熱休克蛋白70-2基因多態(tài)性與糖尿病腎病的相關(guān)性研究

程怡 李紅 尹雪瑤 董雪紅 盧薇娜 宣君麗

●論著

熱休克蛋白70-2基因多態(tài)性與糖尿病腎病的相關(guān)性研究

程怡 李紅 尹雪瑤 董雪紅 盧薇娜 宣君麗

目的 探討熱休克蛋白70-2（+1538A/G）基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性分析技術(shù)檢測261例2型糖尿病患者(其中糖尿病腎病組130例，糖尿病非腎病組131例）和129例健康對照組的熱休克蛋白70-2（+1538A/G）基因多態(tài)性。結(jié)果糖尿病腎病組、糖尿病非腎病組和健康對照組間熱休克蛋白70-2（+1538A/G）基因型和等位基因分布均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0．05）；與AG基因型組相比，GG基因型組舒張壓水平較低，而HDL-C較高（均P＜0．05）。二元logistic回歸分析進(jìn)一步顯示GG基因型是舒張壓增高的保護(hù)因素，OR值為0．331（95%CI 0．111～0．983，P＜0．05）。結(jié)論HSP70-2（+1538A/G）基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病的易感性無相關(guān)關(guān)系，但GG基因型是2型糖尿病患者舒張壓增高的保護(hù)因素，同時還可能影響HDL-C水平。

熱休克蛋白 基因多態(tài)性 糖尿病腎病

高糖所致的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是糖尿病腎病（DN）的重要發(fā)病機(jī)制之一[1]。熱休克蛋白是機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下合成的一種分子伴侶蛋白，而其中熱休克蛋白70（HSP70）是細(xì)胞內(nèi)數(shù)量最豐富的一類熱休克蛋白[2]，有研究表明，HSP70在糖尿病患者的腎臟細(xì)胞中表達(dá)異常[3]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DN的發(fā)生具有明顯遺傳異質(zhì)性和遺傳易感性，對于HSP70基因是否與DN的易感性相關(guān)，目前國內(nèi)尚無相關(guān)研究。因此，我們選取HSP70的其中一個基因（HSP70-2），分析該基因多態(tài)性與中國漢族人群2型糖尿病腎病的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 來自杭州市某社區(qū)的2型糖尿病患者（DM組）共261例，男128例，女133例，年齡40～85（66.68± 8.66）歲。根據(jù)1999年WHO糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)確診。所有研究對象均為中國浙江地區(qū)漢族人，相互之間無血緣關(guān)系，排除其他可致腎前、腎后性蛋白尿的疾病，記錄年齡、性別、糖尿病病史及治療史、其他重大疾病史、家族史等，測身高、體重、收縮壓、舒張壓及腰圍，計算BMI，并留取血、尿樣本，測定尿微量白蛋白/肌酐比值（MALB/Cr）、FPG、2hPG、HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDLC、Cr等生化指標(biāo)，利用簡化MDRD公式計算腎小球濾過率（GFR）。另擇健康對照組（HC組）129例，其中男60例，女69例，年齡45～66（53.96±5.27）歲，選自杭州市某社區(qū)的健康人群，均為漢族人，實驗室檢查證實無糖尿病，無高血壓、心臟病、肝臟和腎臟疾病史，且無糖尿病、腎病家族史。DM組和HC組相比，性別分布無明顯差異（P＞0.05），而DM組年齡明顯＞HC組（P＜0.05）。

根據(jù)MALB/Cr將DM組患者分為糖尿病腎病組（DN+組，130例，MALB/Cr≥30mg/g）和糖尿病非腎病組（DN-組，131例，MALB/Cr＜30mg/g）；DN+組中46例服用ACEI或ARB類藥物治療，分為大量蛋白尿亞組（DN+M亞組，31例，MALB/Cr≥300mg/g）和微量蛋白尿亞組（DN+m亞組，99例，30mg/g≤MALB/Cr＜300mg/g）；DN-組，均未服用ACEI或ARB類藥物治療。

1.2 方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）技術(shù)檢測多態(tài)性。采用Promega公司的DNA抽提試劑盒提取實驗對象的外周血白細(xì)胞DNA作為模板，聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)上游引物序列5′-ACCCTGGAGCCCGTGGAGAA-3′，下游引物序列5′-CTGCACCGCCGCCCCGTAGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為189bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，上述循環(huán)40次，最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以PstI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色后于紫外線成像儀中觀察。由于+1538G等位基因有PstI酶切位點(diǎn)，所以AA型酶切片段為189bp，AG型為189、116p和73bp，GG型為116、73bp。選取經(jīng)酶切鑒定攜帶不同基因型的PCR產(chǎn)物樣本各一份送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序，與酶切結(jié)果對比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料符合正態(tài)分布的以表示，非正態(tài)分布的以中位數(shù)（四分位距）形式表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，兩組連續(xù)變量間的比較采用t檢驗;計數(shù)資料以頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。計算各組的基因型分布和基因頻率，通過Hardy-Weinberg平衡公式檢驗各組基因型是否達(dá)到遺傳平衡?；蛐蛯κ鎻垑杭癏DL-C的影響采用二元logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 DN+組、DN-組和HC組一般情況及生化特征比較 見表1。

由表1可見，DN+組和DN-組的年齡、收縮壓、舒張壓、腰圍、BMI、FPG、2hPG、LDL-C、HbA1c、TG、MALB/Cr均顯著高于HC組（均P＜0.05），而TC、GFR則顯著低于HC組（均P＜0.05），HDL-C分布在上述3組中無統(tǒng)計學(xué)差異。DN+組的腰圍、BMI、TC、TG及MALB/Cr高于DN-組（均P＜0.05），而病程、GFR明顯低于DN-組（均P＜0.05），其余各項指標(biāo)在兩組間分布趨于一致。

表1 DN+組、DN-組和HC組一般情況及生化特征比較

2.2 HSP70-2基因型和等位基因頻率的組間分布 見表2。

表2 HSP70-2基因型和等位基因頻率的組間分布[例（%）]

由表2可見，全部樣本均未發(fā)現(xiàn)AA基因型，不符合HWE平衡。在DM組與HC組中由HSP70-2（+1538A/G）基因多態(tài)性形成的兩種基因型和兩種等位基因的分布情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)基因型及等位基因頻率分布無統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=0.079、0.020，均P＞0.05）。DN+m、DN+M、DN-及HC各組基因型分布和等位基因頻率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 DM組中AG及GG基因型組間一般情況及生化特征比較 與GG基因型組相比，AG基因型組舒張壓水平明顯增高[（80.67±10.62）vs（76.03±10.38）mmHg，t=3.134，P＜0.05]，HDL-C明顯較低 [（1.37±0.32）vs 2.34±0.71）mmol/L，t=2.34，P＜0.05]，而其他生化指標(biāo)則無統(tǒng)計學(xué)差異。為進(jìn)一步明確基因型對舒張壓及HDLC的影響，分別以舒張壓是否升高（≥90mmHg）及HDL-C是否降低（≤0.91mmol/L）為二分類因變量，基因型、年齡、病程、及其他生化指標(biāo)為協(xié)變量進(jìn)行二元logistic回歸分析，結(jié)果提示GG基因型是2型糖尿病患者高舒張壓的保護(hù)因素，OR值為0.331（95%CI 0.111～0.983，P＜0.05），卻未進(jìn)入影響HDL-C的回歸方程。

3 討論

HSP家族在糖尿病病理生理狀態(tài)中的作用有阻止蛋白變性、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)和防御機(jī)制的促發(fā)[3]，因而HSP的表達(dá)受損可能促使糖尿病一系列并發(fā)癥的發(fā)生[4-5]。本研究以中國浙江地區(qū)漢族人為研究對象，比較了DN+組、DN-組及HC組中HSP70-2（+1538A/G）基因多態(tài)性的分布差異。全部樣本均未發(fā)現(xiàn)AA基因型，此基因位點(diǎn)的基因型分布不符合HWE平衡。Schroder等[6]在關(guān)于HSPA1B基因型（即HSP70-2）及HSPA1L對細(xì)胞因子濃度的影響的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。Contreras-Sesvold等[7]使用不同的引物分析了HSP70-2（+ 1538A/G）基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)各組GG基因型頻率基本相同（與本研究結(jié)果亦基本相符），某些組未發(fā)現(xiàn)AA基因型，而該組的部分AG基因型在另外幾組中提示為AA基因型。本次研究結(jié)果顯示，DN+組和DN-組之間，無論是HSP70-2等位基因頻率，還是基因型頻率均與DN的發(fā)生無顯著性相關(guān)。目前對HSP70-2多態(tài)性與2型DN的相關(guān)研究不多，在波蘭的一項HSP70基因多態(tài)性和DN關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，HSP70-2的GG基因型和G等位基因頻率被證明和DN有明顯相關(guān)性，但此關(guān)系可能和TC及LDL-C升高有關(guān)，且該研究選擇的是HSP70-2基因的同一個SNP可能存在的另一個單核苷酸位點(diǎn)（1267A/G）[8]。Barutta等[9]在誘導(dǎo)4周的糖尿病鼠模型中發(fā)現(xiàn)腎臟外層髓質(zhì)細(xì)胞中HSP70有過度表達(dá)，提示在糖尿病情況下HSP70的表達(dá)存在異常，但是否和DN相關(guān)尚無進(jìn)一步研究。但因糖尿病組高血壓患者有62.8%，其中高血壓早于糖尿病發(fā)生的有31.4%，而DN組高血壓患者占78.5%，其中高血壓發(fā)生更早的占44.6%，而服用ACEI或ARB類藥物治療的比例有35.4%，可能對最終結(jié)果造成影響。

本研究還發(fā)現(xiàn)HSP70-2基因多態(tài)性與舒張壓及HDL-C水平有關(guān)，GG基因型組舒張壓較低，而HDL較高。二元logistic回歸分析進(jìn)一步明確GG基因型是舒張壓增高的保護(hù)因素，但對HDL-C無影響。Li等[10]在對新疆維吾爾族人的研究中發(fā)現(xiàn)HSP70-2（1267G）等位基因降低高血壓發(fā)生的風(fēng)險，這與本文研究結(jié)果相同。Xu等[11]發(fā)現(xiàn)，HSP70在高血壓刺激下的小鼠動脈壁出現(xiàn)異常表達(dá)。而Giacconi等[12]卻發(fā)現(xiàn)，HSP70-2的1267G突變等位基因增加2型糖尿病患者出現(xiàn)大血管軟斑塊的可能。還有在對細(xì)胞外HSP70水平和抗HSP70抗體濃度與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，有明確動脈粥樣硬化疾病患者的血漿HSP70和抗HSP70抗體水平均較有動脈粥樣硬化風(fēng)險或健康對照組有明顯降低[13]。出現(xiàn)上述不一致的結(jié)果可能是由于不同種族間的差異，而本研究中多數(shù)高血壓或DN患者均服用ACEI/ARB類藥物或其他降壓藥物治療，可能對血壓水平造成影響，研究樣本量不夠大（n=390）可能也是造成結(jié)果偏差的原因。故HSP70-2基因多態(tài)性與高血壓及2型糖尿病大血管病變的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。

總之，本研究國內(nèi)首次對中國漢族人HSP70-2（+ 1538A/G）基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，其與2型DN的發(fā)病無相關(guān)關(guān)系，但GG基因型是2型糖尿病患者舒張壓增高的保護(hù)因素，同時還可能影響HDL-C水平，而其確切的臨床意義還有待于進(jìn)一步研究。

[1] Barinder P S K,Stanley F,Venkatash R,et al．High glucose promotes mesangial cell apoptosis by oxidant-dependent mechanism[J]．Am J Physiol Renal Physiol,2003,284:455-466．

[2] Milner C M,Campbell R D．Structure and expression of three MHC-linked HSP70 genes[J]．Immunogenetics,1990,32:242-251．

[3] Atalay M,Oksala N,Lappalainen J,et al．Heat shock proteins in diabetes and wound healing[J]．Curr Protein Pept Sci,2009,10(1): 85-95．

[4] Hooper P L．Diabetes,nitric oxide,and heat shock proteins[J]．Diabetes Care,2003,26:951-952．

[5] Kurucz I,Morva A,Vaag A,et al．Decreased expression of heat shock protein 72 in skeletal muscle of patients with type 2 diabetes correlates with insulin resistance[J]．Diabetes,2002,51: 1102-1109．

[6] Schroder O,Schulte K M,Ostermann P,et al．Heat shock protein 70genotypes HSPA1B and HSPA1L influence cytokine concentrations and interfere with outcome after major injury[J]．Crit Care Med,2003,31(1):73-79．

[7] Contreras-Sesvold C L,Sambuughin N,Blokhin A,et al．A protocol comparison for the analysis of heat shock protein A1B +A1538G SNP[J]．Cell Stress Chaperones,2010,15(2):205-209．

[8] Buraczynska M,Swatowski A,Buraczynska K,et al．Heat-shock protein gene polymorphisms and the risk of nephropathy in pa-tients with Type 2 diabetes[J]．Cli Sci,2009,116(1):81-86．

[9] Barutta F,Pinach S,Giunti S,et al．Heat shock protein expression in diabetic nephropathy[J]．Am J Physiol Renal Physiol,2008, 295(6):1817-1824．

[10] Li J X,Tang B P,Sun H P,et al．Interacting contribution of the five polymorphisms in three genes of Hsp70 family to essential hypertension in Uygur ethnicity[J]．Cell Stress Chaperones,2009 14(4):355-362．

[11] Xu Q,Fawcett T W,Udelsman R,et al．Activation of heat shock transcription factor 1 in rat aorta in response to high blood

[12] Giacconi R,Caruso C,Lio D,et al．1267 HSP70-2 polymorphism as a risk factor for carotid plaque rupture and cerebral ischaemia in old type 2 diabetes-atherosclerotic patients[J]．Mech Ageing Dev,2005,126(8):866-873．

[13] Dulin E,Garc a-Barreno P,Guisasola M C．Extracellular heat shock protein 70 (HSPA1A)and classical vascular risk factors in a general population[J]．Cell Stress Chaperones,2010,15(6): 929-937．

Heat shock protein 70-2 gene 1538A/G single nucleotide polymorphism is not associated with susceptibility of diabetic nephropathy

Heat shock protein(HSP)Gene polymorphism Diabetic neuropathy

2012-02-15）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省重大科技專項計劃（2009C03010-4）；國家科技支撐計劃（2009BAI80B01）

310016 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院內(nèi)分泌科

李紅，E-mail:lihongheyi@126.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the association between HSP70-2 gene polymorphisms and diabetic nephropathy (DN)in patients with Type 2 diabetes mellitus(T2DM)．MethodsThe study included 130 patients with Diabetic nephropathy (DN),129 healthy individuals(HC)and 131 patients with T2DM who were free of nephropathy(DM)．The genotypes of HSP70-2 +1538 A/G were examined by PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)technique．Blood glucose,HbA1c, lipid profiles were also measured．ResultsThere were no statistically differences in genotype distribution and allele frequency of HSP70-2+1538 A/G among DN,DM and HC groups(P＞0．05)．The diastolic blood pressure was lower in GG genotype group while the high density lipoprotein cholesterol was higher,compared to GA genotype(P＜0．05)．ConclusionThe polymorphism of HSP70-2 gene 1538A/G is not associated with susceptibility of diabetic nephropathy in Chinese T2DM．The GG genotype was associated with a reduced risk of increased diastolic blood pressure and lower high density lipoprotein cholesterol．