Glypican-3的血清檢測與原發(fā)性肝癌診斷的研究進(jìn)展

余娟平張瓊徐偉文★李明,2

?綜 述?

Glypican-3的血清檢測與原發(fā)性肝癌診斷的研究進(jìn)展

余娟平1張瓊1徐偉文1★李明1,2

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（glypican-3, GPC3）是繼AFP之后發(fā)現(xiàn)的一個新的肝細(xì)胞癌標(biāo)志物。隨著對GPC3研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)它不但在肝細(xì)胞癌組織中有表達(dá)而且在血清中同樣有表達(dá)。GPC3對HCC診斷的敏感性和特異性較高，尤其在腫瘤發(fā)生的早期，具有極大的臨床應(yīng)用價值，為早期HCC的診斷帶來了希望。

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3；肝細(xì)胞癌；診斷

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，是我國位居第二的癌癥“殺手”，其惡性程度高，病情進(jìn)展快[1]。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計顯示，在肝癌中肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）約占75%，是最常見的肝臟原發(fā)性惡性腫瘤。在我國原發(fā)性肝癌中肝細(xì)胞癌占90% ，病人早期無明顯癥狀，一旦出現(xiàn)癥狀就診，往往已屬中晚期，5年生存率低于10%～15%[2]。

目前，對于小肝癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷，腫瘤標(biāo)志物檢測方便、快捷，具有優(yōu)勢。國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）發(fā)布的《腫瘤標(biāo)志物類定量檢測試劑注冊申報資料指導(dǎo)原則》中指出，理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有以下特性：特異性好，便于良、惡性腫瘤的鑒別；與病情嚴(yán)重程度、腫瘤大小或分期有直接關(guān)系；檢測治療效果，腫瘤標(biāo)志物濃度增高或降低與治療效果相關(guān)；預(yù)測復(fù)發(fā)，疾病復(fù)發(fā)時腫瘤標(biāo)志物水平明顯異常。近期的國內(nèi)外研究顯示, glypican-3（GPC3）在人類HCC組織及血清中有顯著的表達(dá)，尤其是在AFP陰性的HCC中GPC3亦有表達(dá)。其對原發(fā)性肝癌的診斷具有較高的敏感性和特異性，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[3]。血清中GPC3的測定作為HCC的診斷，特別是早期診斷、鑒別診斷、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及治療效果評價等方面具有重要價值。本文就GPC3在HCC血清學(xué)方面的研究進(jìn)展作一概述。

1 GPC3的結(jié)構(gòu)

GPC3于1996年被Pillia在研究Simpson-Golabi-Behmel綜合癥（SGBS）時從人胚胎中發(fā)現(xiàn)[4]。GPC3基因定位在人染色體Xq26[5]，其基因組結(jié)構(gòu)全長大于900 kb，是人類基因組中最大的基因之一。該基因5'端朝向端粒區(qū)，3'端朝向中心粒區(qū)，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成。啟動子區(qū)有許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。編碼的GPC3蛋白前體為580個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量約為66 kDa。GPC3是Glypican家族的一員，其結(jié)構(gòu)具有Glypican家族的共同特點(diǎn)，如中央球狀結(jié)構(gòu)空間、C端糖胺聚糖側(cè)鏈連接位點(diǎn)等。GPC3基本結(jié)構(gòu)包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素鏈和糖基化磷脂酰肌醇。GPC3的核心蛋白下游富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)區(qū)的下端，即第358位精氨酸和359位絲氨酸處可被酶切割成兩段，使N-端約含40 kDa的GPC3蛋白成為可溶性蛋白片段（sGPC3）而分泌入血[6]。

2 GPC3在肝癌診斷中的價值

近年來國內(nèi)外的研究基本上都一致認(rèn)為GPC3是原發(fā)性肝癌的特異性標(biāo)志物，具有理想腫瘤標(biāo)志物的特性，對診斷HCC有較高的敏感性和特異性。在AFP陰性的HCC中，GPC3呈陽性表達(dá)。因此，聯(lián)合檢測GPC3和AFP可以大大提高HCC的早期檢出率。

2.1 GPC3在HCC組織中的表達(dá)

Wang等[7]發(fā)現(xiàn)GPC3在HCC病人的組織中陽性率為83.4%（45/54）,而在其他良性肝病、肝轉(zhuǎn)移瘤和肝膽管細(xì)胞癌中均呈陰性。Capurro等[8]研究顯示GPC3在HCC病人組織中陽性率為72%（21/29）,在正常及良性肝病組織中未見表達(dá)，此結(jié)果與Wang F H等的結(jié)果基本一致。Llovet等[9]報道在丙型肝炎肝硬化背景下的早期肝癌組織（＜ 2 cm結(jié)節(jié)）中GPC3的表達(dá)為100%陽性，而在其他良性肝病和正常肝組織中為陰性。Sha fi zadeh等[10]研究顯示GPC3在鑒別低分化HCC時敏感性較高。這些研究都表明GPC3是原發(fā)性肝癌的一種特異標(biāo)志物。

2.2 原發(fā)性肝癌患者血清中GPC3的表達(dá)

GPC3通過糖基磷脂酰肌醇錨定于細(xì)胞膜表面，但其第358位精氨酸和359位絲氨酸處可被酶切割，產(chǎn)生的N末端片段可入血被檢測到，這對于臨床檢測來說是一個福音。多項(xiàng)研究表明GPC3不僅可以在血清中被檢測到，而且具有較高的陽性檢測率和特異性，同時與AFP相比是一個獨(dú)立的標(biāo)志物，GPC3與AFP的聯(lián)合檢測可明顯提高HCC的診斷敏感性。

Yao等[11]研究顯示在HCC患者中，組織GPC3 mRNA、組織GPC3及血清GPC3陽性率分別為100%、100%、77.8%。Capurro M等[8]將血清GPC3檢測結(jié)果與癌組織陽性率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示血清GPC3陽性率為53%（18/34）略低于組織陽性率72%，血清GPC3的測值范圍在150～3 000 ng/mL，正常人（0/53）和肝炎病人（0/18）血清GPC3測值均為陰性。在20例肝炎肝硬化病人中僅有一例血清GPC3測值為117 ng/mL，顯示有所升高。統(tǒng)計結(jié)果顯示，HCC組GPC3水平與正常人、肝炎及肝硬化三組有顯著差異；正常人、肝炎及肝硬化三組之間無顯著差異。同時進(jìn)行AFP檢測，結(jié)果顯示HCC血清陽性率為59%（20/34），患者血清GPC3與AFP水平?jīng)]有直接關(guān)系（P=0.5），聯(lián)合檢測結(jié)果顯示HCC陽性率提高到82%。周偉等[12]用ELISA法對364例HCC、96例慢性乙肝、106例正常人血清進(jìn)行GPC3定量，結(jié)果顯示血清GPC3平均濃度為：HCC患者86.96±422 ng/mL，慢性乙肝11.7±12.23 ng/mL，正常人6.04±9.21 ng/mL。以30 ng/mL為診斷界值，GPC3診斷HCC的敏感性和特異性分別為40%和93%。其同時檢測HCC患者血清中AFP值，結(jié)果AFP的陽性率為49%。聯(lián)合檢測AFP和GPC3時HCC陽性率提升至72%。Hippo等[13]用ELISA夾心法檢測HCC患者、肝硬化、正常人的血清可溶性GPC3含量，結(jié)果顯示HCC組GPC3為4.84±8.91 ng/mL，肝硬化組為1.09±0.74 ng/mL，正常人組為0.65±0.32 ng/mL。三組之間有顯著差異。在分化良好和中度分化的HCC中，GPC3檢測的敏感性優(yōu)于AFP。GPC3和AFP聯(lián)合檢測時，其敏感性從50%提升到72%。

Zhang等[14]用免疫放射法檢測血清GPC3水平，其靈敏度達(dá)到0.5 ng/mL，與HCC相關(guān)的其他標(biāo)志物如AFP、CA19-9、CEA及PSA無交叉反應(yīng)。其分析了正常人血清和HCC患者血清中GPC3水平，確定診斷界值為3.1 ng/mL。在HCC發(fā)生的早期即可檢測到血清GPC3有所增長。HCC患者血清GPC3均值為116.8±98.6 ng/mL，明顯高于正常人（0.86±1.12 ng/mL，P＜0.05）、乙肝（6.73±12.2 ng/mL, P＜ 0.05）、丙肝（13.67±15.08 ng/mL, P＜ 0.05）和肝硬化患者（24.6±24.01 ng/mL, P＜ 0.05）。HCC患者的血清GPC3是正常人的100倍，是肝硬化患者的50倍。因此認(rèn)為血清GPC3水平能很好的區(qū)分HCC與其他良性肝病。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GPC3的診斷敏感性是91.7%，AFP為41.7%，CA19-9為30.5%，AFP與CA19-9聯(lián)合檢測為55.5%?？梢姡珹FP與CA19-9聯(lián)合檢測的敏感性沒有大的改善，GPC3檢測的特異性（100%）明顯高于AFP、CA19-9和AFP/CA19-9，GPC3顯示出高的敏感性和特異性。

El-Shenawy等[15]最新研究顯示血清GPC3水平在HCC病人、肝硬化病人和正常對照三組之間有顯著的差異。通過受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線得出HCC病人與肝硬化病人的最適診斷界值為19 ng/mL，達(dá)到敏感性63.5%、特異性70%；肝硬化病人與正常人的最適診斷界值為0.5 ng/mL，達(dá)到敏感性90%、特異性80%。

從以上研究結(jié)果可見，GPC3在HCC患者血清中有特異性高表達(dá)，可很好地鑒別HCC與其他良性肝病如慢性肝炎、肝硬化等。各個研究結(jié)果均顯示HCC患者血清中GPC3水平明顯高于肝硬化、慢性肝炎及正常人。但我們同時也發(fā)現(xiàn)，不同研究方法檢測得到的血清范圍存在明顯差異，檢測靈敏度也各異，即使使用相同的方法如ELISA法，每個研究者所檢測到的HCC中GPC3血清值相差甚大，如周偉等的檢測值與Hippo等的檢測值相差37倍。除去可能的人群差異之外，實(shí)驗(yàn)室檢測標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、檢測方法等沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)是問題的關(guān)鍵，也是臨床檢測試劑得以應(yīng)用必須解決的環(huán)節(jié)。對于GPC3這樣一個具有良好潛力和應(yīng)用前景的標(biāo)志物，研發(fā)應(yīng)用于臨床的、可靠的檢測方法和試劑盒是目前需解決的問題和方向之一。

2.3 血清GPC3對原發(fā)性肝癌的早期診斷及鑒別診斷

Liu等[16]對75名HCC患者和32名肝硬化患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示AFP對早期HCC的診斷陽性率明顯低于GPC3。75名HCC患者按巴塞羅那臨床肝癌分期系統(tǒng)進(jìn)行分期，其中A期14人，B期23人，C期16人，D期22人。以AFP 400 ug/L為診斷界值，結(jié)果顯示14名A期HCC患者血清中AFP水平均＜ 400 ug/L，陽性率為0%（0/14），B期中陽性率為30.4%（7/23），C期和D期的陽性率為55.3%。同樣檢測這四期患者血清中GPC3值，根據(jù)ROC曲線確定血清GPC3診斷界值值為300 ng/L。檢測結(jié)果顯示，14名A期HCC患者血清GPC3陽性率為50%（7/14）, B期中陽性率為39.1%（9/23）。在這16例血清GPC3值＞ 300 ng/L的患者中僅有3例血清AFP＞ 400 ug/L。對臨床診斷為肝硬化的32例患者分別進(jìn)行血清AFP和GPC3測值，結(jié)果顯示AFP＞400 ug/L有2例，GPC3＞ 300 ng/L有3例。據(jù)此，Liu等[16]認(rèn)為GPC3是早期HCC敏感特異的標(biāo)志物，聯(lián)合檢測GPC3和AFP將大大提高HCC各個階段的診斷敏感性。

Tangkijvanich等[17]用ELISA法研究100例原發(fā)性肝癌病人的血清GPC3表達(dá)情況，陽性率為53%，GPC3血清值在35.5～7 826.6 ng/mL之間。而50例膽管細(xì)胞癌和50例轉(zhuǎn)移癌病人血清GPC3均為陰性。Ligato等[18]用ELISA法研究7例腺瘤、24例原發(fā)性肝癌、17例轉(zhuǎn)移性腫瘤、1例局灶性結(jié)節(jié)性增生患者血清GPC3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示所有腺瘤和局灶性結(jié)節(jié)性增生患者中GPC3均為陰性，轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤中有一例是來歷不明的具有神經(jīng)內(nèi)分泌功能的未分化癌為陽性，其余16例均為陰性。Wang 等[19]研究顯示GPC3是診斷HCC的有效標(biāo)志物，可用于鑒別診斷肝細(xì)胞腺瘤與分化良好的HCC； GPC3的血清水平的變化能預(yù)測一些肝硬化結(jié)節(jié)惡變的可能，認(rèn)為其可能為肝組織癌變的早期標(biāo)志物。

因此，GPC3被認(rèn)為是原發(fā)性肝癌早期特異的標(biāo)志物，是區(qū)別原發(fā)性肝癌與其他良性和惡性肝腫瘤及轉(zhuǎn)移病灶的特異腫瘤標(biāo)志物。

2.4 肝癌血清中AFP與GPC3表達(dá)的相關(guān)性

Lü等[20]用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶連鎖反應(yīng)法（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）研究AFP陰性及陽性的原發(fā)性肝癌病人GPC3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在AFP陰性和陽性病人中GPC3的陽性率分別為90%和90.9%，提出GPC3的表達(dá)和AFP無明顯相關(guān)，GPC3在AFP陰性的病人中仍有較高的表達(dá)。Liu等[21]用針對GPC3的N端片段的抗體進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者血清中AFP與GPC3蛋白的表達(dá)不具有相關(guān)性。由此可見，聯(lián)合檢測AFP和GPC3可提高原發(fā)性肝癌診斷的特異性和敏感性，GPC3對AFP陰性的原發(fā)性肝癌患者具有重要的診斷意義。

2.5 GPC3的表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后

Zhang等[14]研究顯示，GPC3可作為治療效果評價的指標(biāo)，如病人血清GPC3水平在治療后沒有下降，提示治療效果不佳。因此，在治療過程中連續(xù)監(jiān)測血清GPC3水平的變化有助于療效的判斷。Ning等[22]研究表明GPC3的表達(dá)與HCC手術(shù)后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。HCC術(shù)后GPC3高表達(dá)患者的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險是GPC3低表達(dá)患者的3.214倍。生存分析顯示，GPC3高表達(dá)的HCC患者的總生存期明顯短于GPC3低表達(dá)的HCC患者（P=0.003）。該研究表明，GPC3是預(yù)測HCC預(yù)后和術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的有效標(biāo)志物。Shirakawa等[23]對107例接受手術(shù)治療的患者進(jìn)行5年隨訪，發(fā)現(xiàn)GPC3陽性組的5年生存率（54.4%）明顯低于GPC3陰性組（87.7%）。16例首選手術(shù)治療的GPC3陰性患者，在隨訪期間均沒有死亡。多因素分析顯示，GPC3的表達(dá)情況是肝癌獨(dú)立的預(yù)后相關(guān)因素。

3 展望

由上可知，GPC3在肝細(xì)胞癌中特異性高表達(dá)，而在非肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)不表達(dá)，其在肝細(xì)胞癌的診斷與鑒別診斷方面有重要的臨床價值。動態(tài)觀察外周血中GPC3表達(dá)水平有助于判斷肝癌患者的預(yù)后、復(fù)發(fā)等情況,有望成為判斷肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個有意義的預(yù)測指標(biāo)。GPC3在肝癌患者尤其是小肝癌患者及AFP陰性的肝癌患者中有較高的敏感性和特異性,是目前發(fā)現(xiàn)的在AFP陰性肝癌中表達(dá)率較高的特異標(biāo)志物。因此，GPC3在肝癌的早期診斷方面臨床意義重大。聯(lián)合檢測GPC3和AFP可望顯著提高肝癌的早期診斷率。由于GPC3是一個新穎的腫瘤標(biāo)志物，其臨床意義較大，目前GPC3的血清學(xué)檢測沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，尚無成熟的血清檢測試劑產(chǎn)品可大規(guī)模應(yīng)用于臨床。因此，研發(fā)高端的GPC3免疫學(xué)檢測試劑，以促進(jìn)其盡快地應(yīng)用到臨床研究和疾病診斷中，已成為目前生物醫(yī)藥及臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域所思考和關(guān)注，并期望得以實(shí)施解決的問題。

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Advances in the relationship between the detection of glypican-3 in serum and the diagnosis of primary hepatic carcinoma

YU Juanping1, ZHANG Qiong1, XU Weiwen1★, LI Ming1,2
(1.Biological Technology Institute, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China; 2.DA An Gene Co., Ltd. of Sun Yat-sen University, Guangdong, Guangzhou 510660, China.)

Glypican-3(GPC3) was con fi rmed to be a novel tumor marker for hepatocellular carcinoma(HCC) besides alpha-fetoprotein(AFP). With the constant deepening of GPC3 research, it was found not only in tissues of patients with HCC but also in the serum. In the diagnosis of HCC, there were higher sensitivity and speci fi city, especially in the early stage, which had great value in clinical application, and bring new hope for the diagnosis of HCC.

Glypican-3; Hepatocellular Carcinoma; Diagnosis

國家863項(xiàng)目（2012AA020205）；廣東省產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目（2010B090400422）

1.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州 510515 2.中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，廣東，廣州 510660

★通訊作者：徐偉文，E-mail:xu_sandy2006@126.com