姜黃素拮抗環(huán)磷酰胺致小鼠正染紅細(xì)胞微核形成的初步研究*

劉效筠，靳　怡

(1.湖北省黃石市中心醫(yī)院,黃石　435000；　2.湖北省黃石市疾病控制中心，黃石　435000)

環(huán)磷酰胺(CPP)為氮芥與磷酰胺基結(jié)合而成的化合物，是臨床常用的烷化劑類免疫抑制劑，可用于治療各種自身免疫性疾病，即能抑制細(xì)胞增殖，非特異性殺傷抗原敏感性小淋巴細(xì)胞，限制其轉(zhuǎn)化為免疫母細(xì)胞。

臨床運(yùn)用中發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺具有較大的毒副作用，如有明顯的胃腸道反應(yīng)；大劑量使用可導(dǎo)致血小板減少，甚至貧血；高濃度使用時(shí)，易造成出血性膀胱炎；抑制卵細(xì)胞發(fā)育，影響生育。遺傳毒理學(xué)研究表明，環(huán)磷酰胺對(duì)人體遺傳物質(zhì)具有很強(qiáng)的致突變性，常導(dǎo)致染色體的結(jié)構(gòu)畸變。因此，在我國的中草藥資源中積極尋求和使用環(huán)磷酰胺誘變藥物或藥物活性成分，減少環(huán)磷酰胺的毒性，并提高其用藥安全是非常重要的。

姜黃素(curcumin)是從姜黃的根莖中提取的一種天然有效成分，屬多酚類化合物，結(jié)晶狀粉末，呈橙黃色。分子式為C21H20O6，相對(duì)分子質(zhì)量為368.39。姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和抗突變等廣泛的藥理作用，是當(dāng)今國際上重點(diǎn)研究的天然成分之一[1,2]。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)儀器和材料

1.1.1受試藥物姜黃素(分析純浙江省溫州市東升化工試劑廠，批號(hào)20110613)；注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)20111022)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種白色小鼠清潔級(jí)40只，體重20～25 g，雌雄各半，湖北中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.1.3主要儀器與器材普通光學(xué)顯微(9SE-Z型日本NIKON 公司);數(shù)碼相機(jī)(IXUS-60型日本CANON 公司。

1.1.4主要試劑甲醇(methanol)，吉姆薩染料(Giemsa stain)，酸緩沖液(phosphate buffer solution)。

1.2方法

1.2.1分組及給藥方法

1.2.1.1姜黃素混懸液的配制 姜黃素易溶于有機(jī)溶劑，而在水中的溶解度很低，本實(shí)驗(yàn)利用淀粉混懸液加入姜黃素進(jìn)行充分混勻配制成姜黃素淀粉混懸液。

1.2.1.2分組情況 將40只小鼠平均分五組，分別為CPP組、高劑量組、中劑量組、低劑量組和空白組，每組各有8只小鼠。

1.2.1.3給藥方法高劑量組200 μg/g·d-1、中劑量組100 μg/g·d-1、低劑量組50 μg/g·d-1，按各組劑量要求，以不同濃度姜黃素淀粉混懸液給小鼠連續(xù)灌胃6 d，1次/d，0.5 ml/次；空白對(duì)照組與陽性對(duì)照組灌服等量的淀粉混懸液。于第6 d灌胃后，CPP組與高、中、低三個(gè)劑量組小鼠腹腔注射濃度為0.4 mg/ml的環(huán)磷酰胺1 ml，空白對(duì)照組注射生理鹽水1 ml。

1.2.2微核標(biāo)本的制備采用涂片法制備小鼠外周血正染紅細(xì)胞的微核標(biāo)本，事先準(zhǔn)備好80片用玻璃筆刻制有組別標(biāo)記的載玻片。①取材：分別于注射環(huán)磷酰胺24 h與48 h后，用剪刀剪去小鼠尾部末端1 mm。②制片：將尾血擠出，滴在載玻片上，然后推片約3～5 cm。③固定：涂片自然干燥后，放在甲醇中固定10 min。④染色：干燥后的涂片用Giemsa工作液(1份吉姆薩原液與9份磷酸緩沖液混勻，pH為7.2)染色5～10 min，清水沖洗，晾干并保存。

1.2.3微核的計(jì)數(shù)與觀察用雙盲法閱片，選擇分布均勻，染色較好的區(qū)域，在油鏡下計(jì)數(shù)小鼠正染紅細(xì)胞微核。使用數(shù)碼相機(jī)的典型標(biāo)本顯微攝影記錄來拍攝標(biāo)本。觀察小鼠外周血微核標(biāo)本為小鼠正染紅細(xì)胞的微核。用吉姆薩染液染色后，正染紅細(xì)胞呈橙黃色。典型的微核為紫色或紫紅色，大小是紅色的血細(xì)胞直徑的1/20～1/3。邊緣光滑整齊，圓形，單一，嗜色性和核質(zhì)相同。以1000為每只動(dòng)物選取的總細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)，觀察并記錄細(xì)胞中含有的微核數(shù)，用千分率來表示微核率。微核率=含微核的正染紅細(xì)胞數(shù)/觀察的正染紅細(xì)胞數(shù)×1000‰。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各劑量組間的比較用方差分析，對(duì)微核率進(jìn)行直線相關(guān)性分析。利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以P<0.05為差異有顯著意義。

2　結(jié)果

24 h與48 h小鼠外周血正染紅細(xì)胞MN實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1　24 h與48 h小鼠外周血正染紅細(xì)胞MN實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：CPP組、高劑量組、中劑量組和低劑量組與空白組比較，*P<0.05；48h與24h比較，△P<0.05

3　討論

微核(MCN)是指位于細(xì)胞漿中獨(dú)立于主核的核小體,主要由外界損害因素作用細(xì)胞后,導(dǎo)致細(xì)胞染色體丟失或斷裂,從而在胞漿中形成1 個(gè)或數(shù)個(gè)小核[3]。因此在染色體遺傳性疾病和癌癥的早期診斷等方面，微核試驗(yàn)是一種理想的方法。 環(huán)磷酰胺具有較大的毒副作用，遺傳毒理學(xué)研究表明，環(huán)磷酰胺對(duì)人體遺傳物質(zhì)具有很強(qiáng)的致突變性，常導(dǎo)致染色體的結(jié)構(gòu)畸變。已經(jīng)研究確認(rèn)，環(huán)磷酰胺能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生微核，這是在染色體畸變情況下產(chǎn)生的效果。

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)顯示用0.4 mg/ml環(huán)磷酰胺處理24 h后，CPP組的小鼠正染紅細(xì)胞微核率為(9.83±0.28)‰，而姜黃素低劑量組降低至(8.13±0.31)‰，姜黃素中劑量組降低至(6.24±0.24)‰，姜黃素高劑量組降低至(4.39±0.21)‰，由此可見，在不同濃度梯度的姜黃素組中，可以明顯地觀察到姜黃素劑量越高，其相應(yīng)分組的微核率越低。將對(duì)照組與CPP組對(duì)比顯示，CPP組細(xì)胞經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)后微核率明顯高于對(duì)照組。同理分析48 h數(shù)據(jù)亦可發(fā)現(xiàn)相同量效關(guān)系。比較24 h與48 h實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，隨著時(shí)間推移， 48 h各組微核率橫向比較均高于24 h。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，姜黃素對(duì)CPP誘導(dǎo)小鼠正染紅細(xì)胞微核的產(chǎn)生有抑制作用，且抑制作用與姜黃素的濃度梯度成正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠拮抗環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠正染紅細(xì)胞微核的產(chǎn)生，減少環(huán)磷酰胺的遺傳物質(zhì)致突變性及毒性，并能輔助提高環(huán)磷酰胺的臨床用藥安全。

1MIGUEL LOPEZ-LAZARO. Anticancer and carcinogenic properties of curcumin:Considerations for its clinical developmeng as a cancer chemopreventive and chemotherapeutic agent[J].Mol Nutr Food Res,2008,52：103

2MAHESHWARI R K,SINGH A K,GADDIPATI J,etal.Multiple biologicl activities of curcumin:A short review[J].Life Sciences,2006,78(18)：2081

3曹佳,林真,余爭平.微核試驗(yàn)——原理、方法及其在人群監(jiān)測和毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[M]. 北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2000 :1-9