發(fā)酵支原體和梨支原體致死性感染小鼠胸腺細(xì)胞 Fas/FasL表達(dá)與多器官損傷

溫秀姝 沈丹丹 周麗萍

發(fā)酵支原體和梨支原體致死性感染小鼠胸腺細(xì)胞 Fas/FasL表達(dá)與多器官損傷

溫秀姝 沈丹丹 周麗萍

目的 探討發(fā)酵支原體（Mf）和梨支原體（Mpi）感染小鼠胸腺細(xì)胞Fas/FasL表達(dá)與多器官損傷相關(guān)性。 方法 55只清潔級(jí)ICR小鼠，分實(shí)驗(yàn)組24只（免疫抑制Mf、Mpi感染組）及對(duì)照組31只（非免疫抑制Mf感染和NS組）。感染組分別腹腔注射0.3ml Mf和Mpi標(biāo)準(zhǔn)菌株（6×108-9/ml），NS組注入相同量0.9%氯化鈉注射液。計(jì)算各組小鼠死亡率，取其血清進(jìn)行支原體再培養(yǎng)，免疫組化法分析小鼠胸腺細(xì)胞Fas/FasL的表達(dá)，電鏡觀察死亡小鼠心、肺、肝和腎的超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組小鼠在感染3～5d后100%死亡（24/24），與非免疫抑制Mf感染對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。胸腺細(xì)胞Fas/FasL高表達(dá)與心、肝、肺和腎等多器官損傷相一致。 結(jié)論 Mf或Mpi感染小鼠胸腺細(xì)胞Fas/FasL高表達(dá)與心、肺、肝和腎多器官損傷相關(guān)。

發(fā)酵支原體 梨支原體 胸腺 多器官損傷 Fas/FasL

Mycoplasma fermentans Mycoplasma pirum Thymus Multiple organ injury Fas/FasL

發(fā)酵支原體（Mycoplasma fermentans，Mf）、梨支原體（Mycoplasma pirum，Mpi）因在HIV感染者和AIDS患者體內(nèi)成功分離而被稱為艾滋病相關(guān)支原體。國內(nèi)外研究[1]表明,此兩種支原體的協(xié)同感染可能加速AIDS患者器官衰竭的發(fā)生。而多器官功能不全綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是AIDS患者快速死亡常見原因。

穿通支原體和豬鼻支原體慢性感染能抑制p53基因，激活NF-kB并與ras基因協(xié)同促使細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[2]。然而,Mf（Mpi是Mf的變種）作為新的致死性感染病原體，致病機(jī)制與穿通支原體和豬鼻支原體不同。Mf感染后致患者器官暴發(fā)性廣泛壞死，最明顯的是肺、肝，脾、淋巴結(jié)、腎上腺，心臟和腦。在電鏡下可證實(shí)患者器官組織細(xì)胞內(nèi)存在支原體顆粒，采用單克隆抗體免疫組化分析檢出發(fā)酵支原體DNA[3]。前期研究中通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠或孕鼠感染此兩種支原體后3～5d死亡[4-5]，死亡大鼠、孕鼠和仔鼠的心、肝、肺和腎等多器官壞死、空泡化，并在實(shí)驗(yàn)組的鼠肺、或孕鼠肝以及仔鼠的腦組織中電鏡下驗(yàn)證支原體顆粒。本實(shí)驗(yàn)試圖探討Mf和Mpi感染與胸腺細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Fas/FasL表達(dá)的關(guān)系以及與心、肝、肺、腎等多器官損傷相關(guān)性，為Mf和Mpi的致病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 55只6周齡清潔級(jí)ICR雌性小鼠（16～20g/只）由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株與實(shí)驗(yàn)試劑 標(biāo)準(zhǔn)菌株Mf（ATCC19989）、Mpi（ATCC25960）；改良的SP4液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，制備見參考文獻(xiàn)[4-5]；環(huán)磷酰胺（0.2g/瓶）購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份公司（批號(hào)10052621）；SP試劑盒、DAB顯色劑和蘇木素購自北京中杉金橋有限公司；兔抗鼠Fas和FasL多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇 見參考文獻(xiàn)[4-5]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的制備 55只ICR小鼠中35只預(yù)先免疫抑制[隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/（kg· d×5）次制成免疫抑制模型]，分免疫抑制Mf、Mpi感染組各12只，免疫抑制NS對(duì)照組11只；另20只非免疫抑制Mf感染組12只，NS對(duì)照組8只。動(dòng)物模型的制備，見參考文獻(xiàn)[4-5]。

1.2.3 死亡率比較 觀察各組小鼠情況，記錄死亡數(shù)及時(shí)間，比較死亡率。

1.2.4 血清采集再培養(yǎng) 各組死亡小鼠心臟采血，2500rpm離心20min，取上層血清無菌接種于SP4培養(yǎng)基，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，每天觀察至顏色變化至黃色（一般3～5d），即為可疑“陽性”。再將培養(yǎng)物接種至固體培養(yǎng)基（肝消化湯瓊脂），置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48h，若高倍鏡下出現(xiàn)典型“油煎蛋”樣菌落即可確認(rèn)為支原體再培養(yǎng)陽性。

1.2.5 Fas/FasL凋亡蛋白的檢測(cè) 分別取各組死亡小鼠胸腺組織1cm×1cm×1cm，經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜后，按常規(guī)方法制成蠟塊，連續(xù)切片，片厚4μm。采用SP法進(jìn)行常規(guī)的免疫組化染色，一抗為兔抗鼠Fas多克隆抗體（1∶200）和兔抗鼠FasL多克隆抗體（1∶200），二抗為山羊抗兔IgG，石蠟切片脫蠟至水，免疫組化檢測(cè)采用高壓抗原修復(fù)及SP染色法，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色劑室溫下顯色，蘇木素復(fù)染，陰性對(duì)照用PBS替代一抗，其余步驟同上。結(jié)果判斷：400倍光鏡下觀察以胞質(zhì)及胞膜被染成棕黃色或棕褐色者為陽性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取3～5個(gè)代表性視野，用Nikon E-800照相系統(tǒng)拍照保存。應(yīng)用IPP分析軟件測(cè)定切片中陽性蛋白區(qū)域的累積光密度值（IOD值）。

1.2.6 電鏡樣本制作及觀察 取各感染組（12h和死亡鼠各1只）胸腺、心、肝、肺和腎組織各0.5cm×0.5cm×0.5cm，置入電鏡固定液，經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，丙酮酸梯度脫水，Epon-812環(huán)氧樹脂包埋，RMC-PT超薄切片機(jī)切片，超薄切片經(jīng)鉛-鈾雙重染色，H-7500透射電鏡下觀察并拍片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用表示。Fisher確切概率法分析死亡率，方差分析和LSD檢驗(yàn)分析Fas和FasL蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 死亡率比較 Mf和Mpi感染組小鼠均在感染3～5d后死亡 (100%)，非免疫抑制Mf感染組死亡2只(16.7%)，正常NS對(duì)照組及免疫抑制NS對(duì)照組均無小鼠死亡。Mf和Mpi感染組死亡率與其他3組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01）。

2.2 血清再培養(yǎng)結(jié)果 NS對(duì)照組未見支原體菌落，各感染組支原體分離培養(yǎng)均見“油煎蛋”樣陽性菌落，為Mf或Mpi再培養(yǎng)陽性。

2.3 Fas/FasL蛋白免疫組化檢測(cè) Mf感染組Fas蛋白IOD值77 082.40±12 093.40，Mpi感染組為10 5462.95± 23 525.31，較非免疫抑制感染組21 006.39±9 372.51及對(duì)照組13 583.04±4756.39明顯升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01）。而Mf或Mpi感染組FasL蛋白IOD值也明顯升高，分別是92 191.71±8 322.01及115 523.42±26 150.27，與非免疫抑制感染組47 013.15±12 332.40及對(duì)照組9 965.25±4 723.46比較，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01）。Mf和Mpi感染組和對(duì)照組Fas/FasL表達(dá)（圖1，見插頁）。

2.4 超微結(jié)構(gòu)觀察 感染組小鼠心、肝、肺和腎等多器官廣泛損傷，感染12h后胸腺組織細(xì)胞已發(fā)生超微結(jié)構(gòu)改變，至死亡時(shí)胸腺細(xì)胞胞核嚴(yán)重固縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化。感染組細(xì)胞Fas和FasL的陽性表達(dá)顯著升高提示凋亡加速。并且，胸腺細(xì)胞Fas/FasL高表達(dá)與胸腺、心、肺、肝和腎等多器官炎癥、壞死損傷相一致（圖2，見插頁）。

3 討論

Fas廣泛表達(dá)于胸腺、肺等組織細(xì)胞表面，與其相應(yīng)配體FasL共同介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有實(shí)驗(yàn)提示機(jī)體在感染、炎癥過程中，免疫細(xì)胞表達(dá)FasL與細(xì)胞表面的Fas結(jié)合促使細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡的同時(shí)伴隨著細(xì)胞的炎癥與壞死[6]。研究證實(shí)，從AIDS患者Kaposi’s Sarcoma中或Mf感染致死的患者中分離的Mf均含有HIV-1的基因片段，此基因片段或許增加Mf的致病性[3]。Nicolson等[3]推測(cè)致病性發(fā)酵支原體也能像HIV一樣直接侵入免疫系統(tǒng)攻擊靶細(xì)胞（免疫細(xì)胞），并在細(xì)胞內(nèi)快速增殖，致重要器官（心、肝、肺、腎和腦）組織細(xì)胞壞死，導(dǎo)致患者迅速死亡，以上與我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致。Lo[7]報(bào)道發(fā)酵支原體感染猴子后抑制正常的炎癥免疫反應(yīng)，使抗體反應(yīng)缺如或產(chǎn)生緩慢，隨之演變?yōu)楦髌鞴贀p傷，持續(xù)放大和自我破壞的炎癥過程，導(dǎo)致播散性炎癥細(xì)胞的活化，最終表現(xiàn)為致命的全身系統(tǒng)性感染，嚴(yán)重時(shí)是暴發(fā)性的。MODS是全身性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）進(jìn)行性加重的結(jié)果，其最終后果是不可逆轉(zhuǎn)而快速致死[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)中免疫抑制小鼠在感染Mf或Mpi的3～5d內(nèi)死亡率100%，與非免疫抑制Mf感染對(duì)照組（2/12，16.7%）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。電鏡下提示感染死亡小鼠的胸腺、心、肝、肺、腎等重要器官組織細(xì)胞壞死、空泡化，細(xì)胞中見3層膜結(jié)構(gòu)的支原體顆粒。尤其是免疫抑制Mpi感染組12h胸腺組織見炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞核固縮、變形，線粒體腫大、空泡化等超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果與Lo[7]報(bào)道的猴子體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相一致，尤其是感染小鼠胸腺細(xì)胞Fas/FasL高表達(dá)與多器官損傷一致。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果為發(fā)酵支原體和梨支原體在免疫抑制患者體內(nèi)致病性研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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2012-08-14）

（本文編輯：胥昀）

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20110107）

325000 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心（溫秀姝）；溫州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（周麗萍、沈丹丹）

周麗萍，E-mail：zlpzlp19491949@163.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate expression of Fas/FasL in thymocytes and its relation with multiple organ damage in mice lethally infected by Mycoplasma fermentans(Mf)and Mycoplasma pirum(Mpi).Methods 55 ICR mice were randomly divided into experimental group (immunosuppression+Mf and Mpi infection,n=24)and control groups(non-immunosuppression+Mf infection,and normal group,n=31).Mice in experiment group were injected intraperitoneally with 0.3ml(6×108-9/ml)Mf or Mpi,the NS group was injected with 0.3ml sterile normal saline.The mortality rate was evaluated and serum samples were taken for cultivation of the mycoplasma.The expression of Fas/FasL in mice thymus was analyzed with immunohistochemistry.The ultrastructural changes of thymus,heart,lung,liver and kidney were observed with electron microscopy.Results The mice in experimental group all died (24/24)within 3-5 days after infection.The expression of Fas/FasL in thymocytes was high,which was consistent with the extent of damage in the heart,liver,lung and kidney. Conclusion The high expression of Fas/FasL in thymocytes is correlated with the multi-organ damage in Mf and Mpi infected mice.