參考方法測定血清葡萄糖的測量不確定度評價

謝服役 孫琦 吳巧萍

參考方法測定血清葡萄糖的測量不確定度評價

謝服役 孫琦 吳巧萍

目的 探討參考實驗室對測量不確定度的評定方法和程序。 方法 應(yīng)用美國疾病與預(yù)防控制中心推薦的血清葡萄糖測定參考方法對血清樣本進行測定，分析整個過程中各不確定度分量的來源，按A、B兩類不確定度的計算方式對各分量分別進行評定，計算合成標準不確定度。最后取95%置信區(qū)間，計算出擴展不確定度。 結(jié)果 血清葡萄糖的平均濃度為15.20mmol/L，合成標準不確定度為0.14mmol/L，取95%置信區(qū)間，包含因子k=2，則擴展不確定度U為0.29mmol/L。 結(jié)論 參考實驗室的測量不確定度與傳統(tǒng)的測量誤差相比，更能反映測量的水平，對臨床檢驗工作有一定的指導(dǎo)意義，也為采用標準曲線法定量的，如血清葡萄糖、血清總膽紅素和血清尿素等參考方法測量結(jié)果的不確定度評價提供一定的科學(xué)依據(jù)。

參考方法 血清葡萄糖 測量不確定度 標準不確定度和擴展不確定度

【 Abstract】 Objective To explore the method and procedure for evaluation of measurement uncertainty of serum glucose in reference laboratory. Methods The concentration of glucose in serum samples was measured by the reference method which was recommended by the U.S.Centers for Disease Control and Prevention (CDC),and the sources of each uncertainty component in whole procedure of analysis were identified.The evaluation of uncertainty components was processed by using two types of method,then a combined standard uncertainty was calculated;finally,an expanded uncertainty was given according to 95% confidence interval. Results The average concentration of glucose was 15.20 mmol/L,the related combined standard uncertainty was 0.14 mmol/L and the expanded uncertainty(U)was 0.29 mmol/L(the desired level of confidence of approximately 95%, the coverage factor k=2). Conclusion Compared to the traditional measurement errors,the measurement uncertainty in reference laboratory may reflect the measurement ability better,and which would be helpful for evaluation of measurement uncertainty in reference laboratory.

測量不確定度是表征合理的賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。它是以參數(shù)形式定量表示無法修正的那部分誤差的范圍，是用來表征被測量之值所處區(qū)間的一種評定。在不確定度評估過程中，要對整個實驗的所有步驟進行討論，找出不確定度來源，并進行計算，由數(shù)據(jù)可以清晰得出不確定度分量中起主要作用的因素。通過分析不確定度，把測試分析誤差控制在允許限度內(nèi)，保證測試結(jié)果有一定的精密度和準確度，使分析數(shù)據(jù)在給定的置信水平內(nèi)，有把握達到所要求的質(zhì)量。當發(fā)現(xiàn)質(zhì)量控制數(shù)據(jù)將超出預(yù)先確定的判據(jù)時，應(yīng)采取有計劃的措施來糾正出現(xiàn)的問題，同時采取措施防止報告錯誤的結(jié)果。

為了提高臨床檢驗數(shù)據(jù)的可比性，促進臨床診斷和治療的有效性，歐盟通過體外診斷用品導(dǎo)則（Directive 98/79/EC）要求體外診斷用品的量值溯源性：“校準物質(zhì)/質(zhì)控物質(zhì)定值的溯源性必須通過已有的高一級的參考方法/參考物質(zhì)予以保證”。我國關(guān)于體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質(zhì)賦值的計量學(xué)溯源性（GE/T 21415-2008/ISO 17511:2003）于2008-09開始實施。ISO對溯源性的定義中明確指出比較鏈中每一步都同時給出該值的不確定度。因此，如何評價參考方法測量結(jié)果的不確定度成為一個亟待解決的問題。本文按照美國疾病與預(yù)防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention,CDC）推薦的血清葡萄糖（GLU）測定參考方法（己糖激酶法）[1-2]，并結(jié)合中華人民共和國行業(yè)標準（WS/T 350-2011）[3]，參照GUM 1995、GUM 2003、JJF 1059和CNAS-GL05等標準對測量結(jié)果的不確定度進行評價，以期為采用標準曲線法定量的，如血清葡萄糖[1-2]、血清總膽紅素[4]和血清尿素[5]等參考方法測量結(jié)果的不確定度評價提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本 新鮮血清。

1.2 試劑與儀器 葡萄糖SRM 917c（美國國家標準局，NBS），其余試劑均購自Sigma公司。按照參考方法配制，實驗用水為去離子水。UV-2450紫外可見分光光度計（帶半導(dǎo)體溫控和磁力攪拌）（Shimadzu,Japan）和比色皿[QS，特定光徑（10±0.01）mm]用于吸光度（A）的測定；機械移液器（Eppendorf AG,Germany）用來吸取標準溶液和試劑；SevenMulti型 pH計（Mettler Toledo, Switzerland）用來測定溶液pH值；1524型點溫計（Fluke USA）用于測定溶液和室內(nèi)溫度；XS205DU型分析天平（Mettler Toledo,Switzerland）用于稱取標準物質(zhì)和試劑；HH60型數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水浴箱（常州國華，中國）用于控制試劑和樣本的溫度。

1.3 測定方法 測定原理：在己糖激酶催化下，葡萄糖和ATP發(fā)生磷酸化反應(yīng),生成葡萄糖-6-磷酸與ADP。葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化下脫氫,生成6-磷酸葡萄糖酸，同時使NAD（P）還原NAD（P）H。在NAD（P）轉(zhuǎn)化成NAD（P）H的同時，伴有340nm處摩爾消光系數(shù)的上升，摩爾消光系數(shù)變化與葡萄糖含量成正比,通過檢測339 nm處摩爾消光系數(shù)即可測定血清中葡萄糖含量。本次實驗在1d內(nèi)完成，重復(fù)測定樣本和試劑空白各2次，將測定結(jié)果記錄后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 被測量的數(shù)學(xué)模型 血清葡萄糖的含量c（mmol/L）按下列公式計算：式中，A為樣本的吸光度；b0為校正曲線的截距；k為校正曲線的斜率；fc為標準溶液濃度修正因子。

2.2 不確定度的來源分析 測量不確定度的主要來源有樣本的A值、校正曲線擬合、標準溶液濃度（包括標準物質(zhì)稱量、定容、稀釋、再定容）和測量重復(fù)性。取樣體積、水浴時間等因素已在重復(fù)性中體現(xiàn)，故不單獨考慮這些因素。

2.3 分析和量化不確定度分量 標準和實際樣本測定：按參考方法進行重復(fù)測定，測量數(shù)據(jù)見表1。

表1 標準和樣本的測量數(shù)據(jù)

2.3.1 重復(fù)性（rep） 由表1可知，實際樣本用參考方法進行兩次測定，其標準偏差為0.0055，那么重復(fù)性導(dǎo)致的標準不確定度為：

2.3.2 A值校準引起的不確定度 已知UV-2450紫外可見分光光度計的校準證書給出的吸光度擴展不確定度U=0.005，k=2，us（A）=0.005/2=0.0025。

2.3.3 標準溶液的不確定度 標準溶液的濃度可由下面公式計算得出：式中，m為稱取標準物質(zhì)的質(zhì)量（g）；V500ml為母液的體積（500ml）；V100ml為稀釋液的體積（100ml）；Vx為移取母液的體積（x=0、5、10、20、30、40ml）

其不確定度來源包括標準物質(zhì)稱量、定容、稀釋、再定容等幾個因素?，F(xiàn)逐個分析和量化各分量的不確定度，最后合成標準溶液的不確定度。

2.3.3.1 標準物質(zhì)質(zhì)量 稱取標準物質(zhì)約5.000g。采用減量法稱量，包括塑料稱量盤和毛重2次稱量。不確定度主要由天平校準產(chǎn)生。天平校準有3個不確定度來源：線性、重復(fù)性和偏載[6]。 u天平=標準物質(zhì)由兩次稱量得到，那么，其不確定度為：

2.3.3.2 標準溶液母液體積（V500ml） V500ml主要受到容量瓶校準和溫度效應(yīng)的影響。

2.3.3.2.1 校準 制造商（AS One）提供20℃、體積為（500±0.15）ml的容量瓶，按三角分布計算標準不確定度為

2.3.3.2.2 溫度效應(yīng) 假設(shè)溫度變化范圍±4℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，近似矩陣分布，500ml水溶液產(chǎn)生的標準不確定度為

校準和溫度效應(yīng)相互獨立，將這兩個分量合成，V500ml的標準不確定度為：

2.3.3.3 移取母液體積（Vx） Vx主要受到移液管校準和溫度效應(yīng)的影響。其引起不確定度的計算過程如表2所示。

表2 移液管的不確定度

移取母液體積為30和40ml時，其不確定度需要進一步合成。通過計算可以得出移取30ml和40ml時，所引起的標準不確定度分別為0.0235 ml和0.0281ml。

2.3.3.4 稀釋液體積（V100m）l標準溶液V100ml主要受到容量瓶校準和溫度效應(yīng)的影響。

2.3.3.4.1 容量瓶校準 制造商（AS One）提供20℃、體積為（100±0.08）ml的容量瓶按三角分布計算標準不確定度為：

2.3.3.4.2 溫度效應(yīng) 假設(shè)溫度變化范圍±4℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，近似矩陣分布，100ml水溶液產(chǎn)生的標準不確定度為：

校準和溫度效應(yīng)相互獨立，將這兩個分量合成，V100ml的標準不確定度為：

2.3.3.5 合成標準溶液的不確定度 因各分量之間沒有相關(guān)性，故標準溶液的合成標準不確定度根據(jù)下面公式合成。

標準溶液修正因子的標準不確定度可以用下面公式表示：

由于（x=0，5，10，20，30，40ml）各點的計算結(jié)果非常相近，計算u（fc）時一般取中位數(shù)。但本文為了計算簡便，用代替?！?.00078

2.3.4 由回歸方程求得血清葡萄糖的濃度

2.3.4.1 回歸方程 根據(jù)表1中標準溶液的濃度對吸光度作圖所得到的標準曲線見圖1。

圖1 標準溶液的校正曲線

設(shè)回歸方程為：A=b0+kc

用最小二乘法求回歸方程：b0=-n=0.06293，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，欲求c的不確定度，應(yīng)先求A、k、b0的不確定度，然后再合成。

2.3.4.2 回歸方程各項不確定度 將b0和k代入公式，求出Ai殘差νi=[Ai-（a+kci）]的實驗標準差sc/A:

斜率k

截距b0

k和b0的協(xié)方差：

k、b0、u（k）、u（b0）、Σvi2等結(jié)果均可在Origin軟件中求得。

已知，A=b0+kc，那么各影響量的靈敏系數(shù)分別為由校正曲線擬合導(dǎo)致的吸光度值的不確定度可以通過下面公式計算：

式中，c為樣本測量結(jié)果的均值。

2.3.4.3 吸光度A的標準不確定度 根據(jù)下面公式可計算出吸光度A的標準不確定度。

c的標準不確定度為：

2.4 合成標準不確定度的計算 血清葡萄糖的合成標準不確定度如下合成：

2.5 血清葡萄糖含量測定結(jié)果的報告 擴展不確定度U=k×uc，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，具有95%置信度時，k=2，U= 0.29mmlo/L。血清葡萄糖含量測定結(jié)果為：（15.20±0.29）mmol/L，k=2。

3 討論

測量不確定度是衡量檢測結(jié)果準確性和可靠性的重要參數(shù)，它在實驗室中正確應(yīng)用可以衡量實驗室科學(xué)管理和檢測水平。因而對其進行合理的分析和評定是實驗室質(zhì)量體系的重要組成部分，也是醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量管理的重要內(nèi)容。我們通過測量血清葡萄糖的實驗來探討醫(yī)學(xué)實驗室對參考方法測定血清葡萄糖的測量不確定度的評定方法，并試圖發(fā)現(xiàn)影響測定血清葡萄糖的主要影響因素。

使用電子表格計算方法[7]計算每個分量對測量結(jié)果的不確定度的相對貢獻。血清葡萄糖的標準不確定度為0.14mmol/L。使用直方圖表示各分量的相對貢獻（圖2），可以得知，吸光度、標準曲線的斜率和截距是影響血清葡萄糖測量不確定度的主要分量。因此，對標準溶液的配制和測定應(yīng)嚴加控制，確保測量結(jié)果具有較小的不確定度。

圖2 各分量的相對貢獻

在對血清葡萄糖測定結(jié)果進行不確定評估時，我們引入標準溶液修正因子（fc）。由于20、30、40ml）各點的計算結(jié)果非常相近，所占的比重又不是很大，因此，本文為了計算簡便，在計算u（fc）時直接用代替（基于正常血清的參考值在標準曲線下方考慮）。

本文試圖將Origin 8.0作圖軟件應(yīng)用到測量不確定度計算過程中，標準曲線中的k、b0、u（k）、u（b0）、Σvi2等結(jié)果均可通過Origin 8.0軟件求得，這樣大大簡化了整個計算過程。

總之，參考方法測定血清葡萄糖的測量不確定度主要來源于標準曲線的斜率、截距和吸光度，因此，對標準溶液的配制和測定應(yīng)嚴加控制，確保測量結(jié)果具有較小的不確定度。臨床實驗室的測量不確定度與傳統(tǒng)的測量誤差相比，更能反映測量的水平。對臨床檢驗工作有一定的指導(dǎo)意義。本文中所描述的評估模式可以為采用標準曲線法定量的，如血清葡萄糖、血清總膽紅素和血清尿素等參考方法測量結(jié)果的不確定度評價提供一定的科學(xué)依據(jù)。

[1]Neese J W,Duncan P,Bayse D,et al.Development and evaluation ofa hexokinase/glucose-6-phosphate dehydrogenase procedure for use as a national glucose reference method.HEW Publication No.(CDC)77-8330.the United States Centers for Disease Contorl,1976.

[2]Neese J W,Duncan P,Bayse D,et al.Development and evaluation of a hexokinase/glucose-6-phosphate dehydrogenase procedure for use as a nationalglucose reference method[J].Clin Chem, 1974,20:878.

[3]陳寶榮,邵燕,陳琦,等.血清葡萄糖測定參考方法[M].北京:中國標準出版社,2011.

[4]Doumas B T,Kwok-Cheung P P,Perry B W,et al.Candidate reference method for determination of total bilirubin in serum: development and validation[J].Clin Chem,1985,21:1779-1789.

[5]Sampson E J,Baird M A,Burtls C A,et al.A Coupled-Enzyme Equilibrium Method for Measuring Urea in Serum:Optimization and Evaluation of the AACC Study Groupon Urea1 Candidate Reference Method[J].Clin Chem,1980,26:816-826.

[6]汪靜,郭健,陳文祥,等.國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(IFCC)酶學(xué)參考方法測定血清ALT活性濃度的不確定度評定[J].中國計量,2009,(9):75-78.

[7]Eurochem/CITACguide.Quantifying uncertaintyin analyticalmeasurement.2nd ed,EUROCHEM,2000.

（本文編輯：沈叔洪）

更正

本刊2012年第34卷第24期第2010頁作者單位更正為“315400余姚市人民醫(yī)院泌尿腎病外科”。

本刊編輯部

Application of reference method in evaluation of measurement uncertainty of serum glucose

XIE Fuyi,SUN Qi,WU Qiaoping.Depart-

ment of Laboratory Medicine, Lihuili Hospital,Ningbo 315041,China

Reference method Serum glucose Measurement uncertainty Standard and expanded uncertainties

2012-08-01）

315041 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院檢驗科