浙南地區(qū)女性人群CYP2D6及MDR1基因多態(tài)性對曲馬多鎮(zhèn)痛效果的影響

馬光泛 陳千煌

浙南地區(qū)女性人群CYP2D6及MDR1基因多態(tài)性對曲馬多鎮(zhèn)痛效果的影響

馬光泛 陳千煌

目的 探討CYP2D6*10等位基因及MDR1 C3435T基因多態(tài)性對浙南地區(qū)女性人群術(shù)后曲馬多鎮(zhèn)痛效果的影響。方法 收集行子宮肌瘤剝除手術(shù)患者194例，手術(shù)結(jié)束前30 min肌肉注射曲馬多，采用患者自控鎮(zhèn)痛（PCA）模式進行術(shù)后鎮(zhèn)痛。抽取外周血，采用聚合酶鏈反應-限制性條帶長度多態(tài)性方法（PCR-RFLP），分析患者CYP2D6*10等位基因及MDR1 C3435T基因多態(tài)性，比較不同基因型患者之間曲馬多的累積量，記錄鎮(zhèn)痛起效時間、持續(xù)時間、VAS及不良反應。 結(jié)果 CYP2D6*10等位基因頻率為52.84%，術(shù)后2、6、12h曲馬多累積量及術(shù)后2、6hVAS的比較，m/m型明顯高于w/w型和m/w型，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MDR1 C3435T等位基因頻率為38.14%，3種不同基因型患者術(shù)后曲馬多累積量及VAS的比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。 結(jié)論在浙南地區(qū)女性人群中，CYP2D6*10等位基因?qū)ηR多鎮(zhèn)痛效果有顯著影響，MDR1 C3435T等位基因?qū)ηR多鎮(zhèn)痛效果無顯著影響。

MDR1 C3435T CYP2D6*10 術(shù)后鎮(zhèn)痛 基因多態(tài)性 曲馬多

曲馬多是一種常用的非麻醉性中樞鎮(zhèn)痛藥，輕中度疼痛作用效果與嗎啡相當，具有對呼吸和心臟抑制輕、長期應用不易成癮、耐受危險性小等特點，近年來廣泛使用于治療輕中度的疼痛及中小型手術(shù)術(shù)后鎮(zhèn)痛。曲馬多在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟代謝，其中O-去甲基曲馬多（M1）是唯一有活性的代謝產(chǎn)物，鎮(zhèn)痛作用是母體藥物的2～4倍。M1主要通過CYP2D6代謝，故曲馬多的藥代動力學和藥效均與CYP2D6的活性相關(guān)。CYP2D6的活性主要受基因的調(diào)控，其基因多態(tài)性達70余種，且發(fā)生率在不同種族中差異明顯[1]。有實驗證實，曲馬多的藥代動力學也受MDR1 C3435T基因多態(tài)性的影響[2]。本研究通過比較CYP2D6*10與MDR1 C3435T不同基因型的浙南地區(qū)女性個體對曲馬多鎮(zhèn)痛效果的差異，以闡述不同基因型對曲馬多代謝及鎮(zhèn)痛效果的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2010-08—2012-03本院婦科行子宮肌瘤剝除手術(shù)患者，共258例，其中64例因采血失敗、不合作、缺乏醫(yī)生隨訪、初期疼痛視覺模擬評分（VAS）＜2以及有嚴重惡心、嘔吐等原因中途退出試驗，實際進入試驗為194例患者，均為漢族，浙南地區(qū)女性，年齡19～55（37.74±10.25）歲，身高147～172（159.34±7.48）cm，體重40～80（55.16±7.11）kg，ASAⅠ～Ⅱ級。排除患有嚴重肝臟和腎臟疾病、糖尿病、抑郁癥、焦慮癥、長期使用止痛藥的患者，術(shù)前1周服用解熱鎮(zhèn)痛類或者阿片類藥物者，使用與曲馬多藥代動力學相抵觸的聯(lián)合制劑者。實驗方案經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者均充分了解研究方案并簽署知情同意書。

1.2 方法 麻醉方式選用連續(xù)硬膜外麻醉，在腰椎2～3間隙行硬膜外穿刺，經(jīng)硬膜外隙給予2%利多卡因和0.5%羅哌卡因連續(xù)硬膜外阻滯，麻醉平面控制在胸8以下，術(shù)中監(jiān)測心電圖、無創(chuàng)血壓、血氧飽和度，術(shù)畢拔除硬膜外導管。曲馬多是術(shù)后唯一使用的鎮(zhèn)痛藥物，在手術(shù)結(jié)束前30min予肌肉注射曲馬多100mg負荷劑量，接上鎮(zhèn)痛泵，采用患者自控鎮(zhèn)痛（PCA）模式。藥物配置：曲馬多2.67mg/ml，甲氧氯普胺0.3mg/ml，共150ml。按持續(xù)量2.0ml/h，PCA量0.5ml，鎖定時間15min給藥，持續(xù)靜脈鎮(zhèn)痛48h。

1.3 觀察指標 鎮(zhèn)痛效果評估指標采用VAS法，0分為無痛，10分為最痛，并在患者靜息狀態(tài)記錄VAS分值。如果鎮(zhèn)痛效果差（靜息下VAS＞4），則額外單次靜脈注射曲馬多50mg直至VAS＜4?；颊呷朐杭从涗沄AS作為基礎對照值，并依次記錄術(shù)后2、6、12、24、48h VAS分值。術(shù)前一晚由固定的精神科醫(yī)生對患者進行抑郁自評量表（SDS）、焦慮狀態(tài)/特性詢問表（STAI）、艾森克個性問卷（EPQ）評估。測評結(jié)束后將粗分根據(jù)相應公式轉(zhuǎn)換成標準分，消除心理因素及其他因素對術(shù)后鎮(zhèn)痛的影響。

1.4 基因型分型

1.4.1 DNA提取 所有受檢者均晨起抽取靜脈血3ml，采用DNA試劑盒（日本Takara公司）提取人白細胞基因組DNA。將提取好的DNA置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 CYP2D6*10基因PCR反應體系、反應條件及電泳分析 CYP2D6*10采用聚合酶鏈反應-限制性條帶長度多態(tài)性方法（PCR-RFLP）分析[3]。PCR反應體系（PCR所需試劑均由日本Takara公司提供）：反應總體積為25μl，其中內(nèi)含2μl基因組DNA，2.5μl 10×PCR反應緩沖液，引物濃度為10pmol/L的上下游引物各0.5μl，Taq酶PCR混合試劑15μl，最后補充去離子水至終體積25μl，置于PCR儀（美國Perkin-Elmer公司）。PCR擴增反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性45s、53℃退火40s、72℃延伸55s，共34個循環(huán)；再72℃繼續(xù)延伸8min。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，上游引物為5′-TCA ACA CAG CAG GTT CA-3′，下游引物5′-CTG TGG TTT CAC CCA CC-3′。PCR產(chǎn)物用Hph I酶（美國NEB公司）酶切，以測定CYP2D6*10突變的等位基因。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，120V，60min，紫外照相。

1.4.3 MDR1 C3435T基因PCR反應體系、反應條件及電泳分析 MDR1 C3435T基因多態(tài)性采用PCR-RFLP分析[4]。PCR反應體系：反應總體積為25μl，其中內(nèi)含2μl基因組DNA，2.5μl 10×PCR反應緩沖液，引物濃度為10pmol/L的上下游引物各0.5μl，Taq酶PCR混合試劑12.5μl，最后補充去離子水至終體積25μl，置于PCR儀。PCR擴增反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性35s、54℃退火35s、72℃延伸60s，共35個循環(huán)；再72℃繼續(xù)延伸6min。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，上游引物為5′-TGC TGG TCC TGA AGT TGA TCT GTG AAC-3′，下游引物5′-ACA TTA GGC AGT GAC TCG ATG AAG GCA-3′。PCR產(chǎn)物用MboI酶（美國NEB公司）酶切，以測定MDR1基因的等位基因。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，130V，60min，紫外照相。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料均以 表示，等位基因、基因型頻率和遺傳平衡定律（Hardy-Weinberg定律）采用χ2檢驗，不同基因型組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 基因分型

2.1.1 CYP2D6*10基因分型 PCR擴增產(chǎn)物長度為394 bp。野生純合型（w/w型）酶切產(chǎn)物為323、71bp，共2個條帶；突變純合型（m/w型）酶切產(chǎn)物有223、100、71 bp，共3個條帶；突變雜合型（m/m型）則有323、223、100、71bp，共4個條帶（圖1）。

2.1.2 MDR1 C3435T基因分型 PCR擴增產(chǎn)物長度為248bp，野生純合型（CC型）為172、60、16bp，共3個條帶；突變雜合型（CT型）為232、172、60、16bp，共4個條帶；突變純合型（TT型）為232、16bp，共2個條帶（圖2）。

2.2 基因突變頻率 CYP2D6*10基因突變頻率為52.84%，w/w型39例，m/w型105例，m/m型50例。MDR1 C3435T突變頻率為38.14%，CC型77例，CT型86例，TT型31例。CYP2D6*10及MDR1 C3435T基因型分布均符合Hardy-Weinberg定律，見表1。

圖1 CYP2D6*10基因分型電泳圖（M為Marker；1、4、5、6、7、10、11為w/w型；3、8為m/m型；2、9為m/w型）

圖2 MDR1 C3435T基因分型電泳圖（M為Marker；6、8為CC型；2、4為CT型；1、3、5、7、9為TT型）

表1 兩種基因型及等位基因頻率

2.3 兩種基因型各子型患者一般資料的比較 見表2。

表2 兩種基因型各子型患者一般資料的比較

由表2可見，兩種基因型各子型患者的年齡、體重、身高、BMI、手術(shù)持續(xù)時間的比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.4 CYP2D6*10不同基因型患者術(shù)后曲馬多累積量及VAS的比較 見表3、4。

表3 CYP2D6*10不同基因型患者術(shù)后PCA鎮(zhèn)痛期間曲馬多累積量（mg）

表4 CYP2D6*10不同基因型患者術(shù)后PCA鎮(zhèn)痛期間VAS比較

由表3、4可見，與w/w型相比，m/m型術(shù)后PCA鎮(zhèn)痛期間曲馬多負荷量及術(shù)后2、6、12h曲馬多累積量均明顯增多，分別增加8.50%、10.40%、2.70%和3.12%，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而與m/w型比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3種不同基因型患者術(shù)后24、48h曲馬多累積量的比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。m/m型術(shù)后2、6h VAS分值均高于w/w型與m/w型，與w/w型相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但與m/w型相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3種不同基因型患者術(shù)后12、24、48hVAS分值的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.5 MDR1 C3435T不同基因型患者術(shù)后曲馬多用量及VAS比較 見表5、6。

表5 MDR1 C3435T不同基因型患者術(shù)后PCA鎮(zhèn)痛期間曲馬多累積量（mg）

表6 MDR1 C3435T不同基因型患者術(shù)后PCA鎮(zhèn)痛期間VAS比較

由表5、6可見，3種不同基因型患者術(shù)后2、6、12、24、48h曲馬多累積量及VAS分值的比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.6 不良反應發(fā)生情況 兩基因型各子組中僅7例患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、大汗等不良反應，其中CYP2D6*10基因w/w型2例，m/w型3例，m/m型2例，MDR1 C3435T基因CC型3例，CT型4例，TT型未發(fā)生。

3 討論

3.1 CYP2D6*10基因多態(tài)性與曲馬多藥效的關(guān)系CYP2D6是具有高度多態(tài)性的異構(gòu)酶，在人群中分為四種代謝表型：慢代謝型、中間代謝型、快代謝型和極快代謝型。本研究CYP2D6*10基因檢測中，w/w型39例、m/w型105例、m/m型50例，等位基因頻率為52.84%，m/w型為25.77%，可以從一定程度上反映該基因在浙南地區(qū)女性人群中的發(fā)生頻率。相關(guān)文獻報道的不同人群CYP2D6*10等位基因頻率如下：廣東57.2%，香港64.7%，臺灣70.0%，新加坡62.0%，高加索5.1%，南美1.5%，東方人的突變頻率高達51%[5-9]。由此可見，CYP2D6*10基因多態(tài)性在高加索人群與蒙古利亞人群之間存在著顯著的種族差異[9]，這種DNA分子水平的差異是CYP2D6酶代謝表型存在種族差異的遺傳基礎[10]。雖然國內(nèi)已有關(guān)于CYP2D6基因多態(tài)性與藥物代謝關(guān)系的研究[11]，但目前尚缺乏關(guān)于浙南地區(qū)女性人群CYP2D6基因表型與曲馬多藥效個體差異的研究，本課題首次系統(tǒng)地闡明了引起浙南地區(qū)女性人群曲馬多藥物代謝及臨床藥效個體差異和種族差異的遺傳因素。

本研究194例子宮肌瘤剝除手術(shù)中，平均疼痛強度在術(shù)后2h內(nèi)達到最大值，隨后趨于平穩(wěn)，術(shù)后大約6h開始呈下降趨勢。與w/w型相比，m/m型曲馬多術(shù)后鎮(zhèn)痛的負荷量和術(shù)后2、6、12h曲馬多累積量分別增加了8.50%、10.40%、2.70%和3.12%，術(shù)后2、6hVAS分值均明顯增高。本實驗結(jié)果表明，CYP2D6*10基因多態(tài)性會影響曲馬多術(shù)后PCA鎮(zhèn)痛早期效果，其中m/w型鎮(zhèn)痛效果較差且術(shù)后首日需要較多的鎮(zhèn)痛藥量，可能因CYP2D6*10基因突變，減慢了體內(nèi)曲馬多向其主要活性代謝產(chǎn)物Ml的轉(zhuǎn)化，進而降低了曲馬多術(shù)后持續(xù)靜脈及PCA鎮(zhèn)痛的效果，增加了鎮(zhèn)痛早期鎮(zhèn)痛藥物的需要量[12]。CYP2D6*10基因多態(tài)性是引起浙南地區(qū)女性人群曲馬多藥物代謝個體和種族差異的重要遺傳因素，同時也是引起曲馬多術(shù)后鎮(zhèn)痛藥效學個體差異的原因之一。

3.2 MDR1 C3435T基因多態(tài)性與曲馬多藥效的關(guān)系國外有研究表明，MDR1基因影響P-糖蛋白功能，限制藥物底物滲透到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的濃度，其中MDR1 3435TT基因型可引起P-糖蛋白的低表達[13]。也有研究表明[2]，歐洲捷克人群中MDR1多態(tài)性可能是影響曲馬多鎮(zhèn)痛效應的重要遺傳因素之一。當前國內(nèi)MDR1基因研究較多的有G2677T、G2677A、C3435T、C1236T、單核苷酸。C3435T在中國健康志愿者中頻率為40%,本研究主要對象為浙南地區(qū)女性人群，突變頻率為38.14%，與上述研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示，MDR1 C3435T基因多態(tài)性CC、CT、TT 3種基因型間48h曲馬多累積量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

國內(nèi)有研究報道，MDR1 C3435T基因多態(tài)性與芬太尼術(shù)后鎮(zhèn)痛效應相關(guān)，CT、TT型患者的芬太尼鎮(zhèn)痛用量顯著低于CC型[14]。而本實驗使用藥物為曲馬多，其鎮(zhèn)痛效果不及芬太尼，在一定程度上縮小了不同基因型組間鎮(zhèn)痛藥物劑量的差異，其次可能P-糖蛋白對曲馬多代謝產(chǎn)物透過血腦屏障的能力影響甚微，或者MDR1 C3435T基因多態(tài)性并非是引起中國浙南地區(qū)女性人群曲馬多鎮(zhèn)痛效果差異的遺傳因素，故導致該結(jié)果與本實驗結(jié)果不一致。由于曲馬多鎮(zhèn)痛作用機制的復雜性,本試驗的研究結(jié)果仍需要多中心、大樣本的研究來證實。

[1]Daly A K.Pharmacogenetics of the major polymorphic metabolizing enzymes[J].Fundam Clin Pharmacolo,2003,17(1):27-41.

[2]Slanar O,Nobilis M,Kvétina J.Pharmacokinetics of tramadol is affected by MDR1 polymorphism C3435T[J].Eur J Clin Phar-macol,2007,63(4):419-421.

[3]Samer C F,Piguet V,Dayer P,et al.Genetic polymorphism and drug interactions:their importance in the treatment of pain[J]. Can J Anaesth,2005,52(8):806.

[4]Shinkai T,De Luca V,Utsunomiya K,et al.Functional polymorphism of the human multidrug resistance gene (MDR1)and polydipsia-hyponatremia in schizophrenia[J].Neuromolecular Med,2008,10(4):362-367.

[5]Gao Y,Zhang Q.Polymorphisms of the GSTM1 and CYP2D6 genes associated with susceptibility to lung cancer in Chinese [J].Mutat Res,1999,444:441-449.

[6]Garcia-Barceló M,Chow L Y,Chiu H F,et al.Genetic analysis of the CYP2D6 locus in a Hong Kong Chinese population[J]. Clin Chem,2000,46(1):18-23.

[7]Wang S L,Lai M D,Huang J D.G169R mutation diminishes the metabolic activity of CYP2D6 in Chinese[J].Drug Metab Dispos,1999,27(3):385-388.

[8]Lee E J,Jeyaseelan K.Frequency of human CYP2D6 mutant alleles in a normal Chinese population[J].Br J Clin Pharmacol, 1994,37(6):605-607.

[9]Ji L,Pan S,Wu J,et al.Genetic polymorphisms of CYP2D6 in Chinese mainland[J].Chin Med,2002,115:1780-1784.

[10]Furman K D,Grimm D R,Mueller T,et al.Impact of CYP2D6 intermediate metabolizer alleles on single-dose desipramine pharmacokinetics[J].Pharmacogenetics,2004,14(5):279-284.

[11]汪國香,黃麗霞,張相彩,等.CYP2D6*10等位基因多態(tài)性對胃癌術(shù)后曲馬多鎮(zhèn)痛效果的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2011,10 (17):465-468.

[12]韓璐,劉潔.CYP2D6基因多態(tài)性及對藥物代謝的影響[J].中國臨床藥理學與治療學,2011,16(1):105-110.

[13]Song P,Lamba J K,Zhang L.G2677T and C3435T genotype and haplotype are associated with hepatic ABCB1(MDR1) expression[J].J Clin Pharmacol,2006,46(3):373-379.

[14]鄧婕,李敏,吳曉智,等.MDR1 C3435T基因多態(tài)性與芬太尼術(shù)后鎮(zhèn)痛效應的關(guān)系[J].中國臨床藥學雜志,2011,20(3):129-132.

Association of CYP2D6 and MDR1 polymorphisms with analgesic efficacy of tramadol in woman patients of Southern Zhejiang Province

MA Guanfan,CHEN Qianhuan.Department of Anesthesiology,Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital

of Wenzhou,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the association of CYP2D6*10 and MDR1 C3435T polymorphisms with analgesic efficacy of tramadol in woman patients of Southern Zhejiang province. Methods One hundred and ninety four patients with hystermyoma undergoing uterine myomatectomy from August 2010 to March 2012.Patients were given with loading dose of tramadol intramuscularly 30 minutes before the ending of surgery and received the postoperative patient-controlled analgesia(PCA). Samples of peripheral blood were collected for DNA isolation.Polymorphisms of CYP2D6*10 and MDR1 C3435T were detected with PCR-RFLP analysis.The differences of tramadol consumption in the genotype groups were monitored and the starting time and duration of analgesia,VAS scores and adverse reaction were observed. Results The allelic frequency of CYP2D6 was 52.84%.The tramadol consumption at 2、6h and 12h after surgery and VAS at 2h and 6h after surgery in m/m type(n=50)were higher than those in w/w(n=39)and m/w(n=105)type(P＜0.05).Variant alleles C3435T in MDR1 gene was seen in frequency of 38.14%.There were no significant differences in postoperative tramadol consumption and VAS among CC type (n=77),CT type (n=86)and TT type(n=31). Conclusion CYP2D6*10 is significantly associated with analgesic efficacy of tramadol in woman patients of Southern Zhejiang province,while C3435T in MDR1 has no such association.

MDR1 C3435T CYP2D6*10 Postoperative analgesia Polymorphisms Tramadol

2012-10-15）

（本文編輯：嚴瑋雯）

325000 溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院麻醉科

馬光泛，E-mail：ma0106003@sohu.com