E-cadherin、CD44v6、MMP2在膀胱尿路上皮癌中的表達及意義

周美玲 許勵 湯琪樂 徐文娟 茹國慶

E-cadherin、CD44v6、MMP2在膀胱尿路上皮癌中的表達及意義

周美玲 許勵 湯琪樂 徐文娟 茹國慶

目的 研究鈣黏附分子E-cadherin（E-cad）、CD44變異體6（CD44v6）和基質金屬蛋白酶（MMP2）在膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma）中的表達及對預后的意義。 方法 應用免疫組化Envision法，檢測105例膀胱尿路上皮癌患者和20例正常體檢者膀胱黏膜E-cad、CD44v6及MMP2的表達情況。結果 20例正常膀胱黏膜中E-cad、CD44v6均正常表達，MMP2均陰性表達，105例膀胱尿路上皮癌中E-cad及CD44v6的異常表達率分別為43．8%（46/105）和58．1%（61/105），MMP2陽性表達為53．3%（56/105）。E-cad、CD44v6的異常表達率和MMP2的陽性表達率與患者腫瘤的病理分級、臨床分期及生存率相關。 結論E-cad、CD44v6的異常表達和MMP2的陽性表達在膀胱尿路上皮癌的演變過程中起著重要作用，可作為監(jiān)測腫瘤惡性程度和預后有效的分子生物學指標之一。

鈣黏附分子 CD44變異體6 基質金屬蛋白酶 膀胱尿路上皮癌

腫瘤細胞的浸潤和轉移必須首先脫離原發(fā)灶，黏附在細胞外基質上，然后降解基質并通過降解的基質進行移動，穿透基底膜進入間質或體液循環(huán)而發(fā)揮作用[1]。因此，細胞與細胞、細胞與細胞外基質間的黏附和相互作用及基底膜的完整是十分重要的。本研究應用免疫組化Envision法檢測鈣黏附分子E-cadherin（E-cad）、CD44變異體6（CD44v6）的異常表達及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase-2，MMP2）過度表達與膀胱尿路上皮癌浸潤能力及預后的關系。

1 資料和方法

1.1 資料來源 收集1984—2010年浙江省人民醫(yī)院病理科90例和杭州鋼鐵集團公司職工醫(yī)院病理科15例膀胱尿路上皮癌患者的膀胱黏膜標本共105例，另選擇20例正常體檢者膀胱黏膜作為對照組，依據(jù)2004版WHO的尿路上皮腫瘤分類標準進行病理分類；非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌（低級別）33例，非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌（高級別）41例；浸潤性尿路上皮癌31例，按UICC.TNM標準分期Ta 41例，T131例，T214例，T315例，T44例。標本均由10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋、常規(guī)切片。對所有患者進行隨訪，其中失訪25例（23.81%）。

1.2 方法 應用免疫組化Envision法，一抗選用鼠抗人E-cad、CD44v6、MMP2單克隆抗體，試劑是由福州邁新試劑公司提供的美國ZYMED公司產(chǎn)品，抗體效價分別為1∶80、1∶50、1∶100。切片常規(guī)脫蠟、水化，Tris液（pH6.0）行微波抗原修復。用已知胃癌陽性切片作陽性對照，陰性對照中一抗用PBS取代。常規(guī)操作，DAB染色。

1.3 結果判定 陽性結果判定：E-cad、CD44v6在細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性：（1）正常表達（++）：切片陽性細胞數(shù)≥90%，（2）異常表達（-/+）：（-）切片內無陽性細胞，（+）切片內陽性細胞數(shù)＜90%。MMP2以細胞質有明顯棕黃色顆粒為陽性。陰性（-）：無陽性細胞；弱陽性（+）：陽性細胞≤10%；陽性（++）：陽性細胞數(shù)為10%～75%；強陽性（+++）：陽性細胞數(shù)≥75%。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，E-cad、CD44v6、MMP2在非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌（低級別），非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌（高級別）和浸潤性尿路上皮癌及不同臨床病理分期間的表達對比分析采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線作圖。

2 結果

2.1 E-cad、CD44v6和MMP2在膀胱尿路上皮癌中的表達 20例正常膀胱黏膜E-cad、CD44v6均呈正常表達，細胞膜為深棕色，分布于細胞交界區(qū)，特別是細胞黏附區(qū)，20例膀胱正常黏膜MMP2為陰性，細胞質內無深棕色顆粒。E-cad及CD44v6在膀胱尿路上皮癌中表達具有明顯異質性，細胞膜染色減少或消失，胞膜、胞質染色交錯分布，其異常表達率分別為43.8%（46/105）和58.1%（61/105）。MMP2陽性表達率為53.3%（56/105），細胞質有明顯棕黃色顆粒。

2.2 E-cad、CD44v6和MMP2表達與膀胱尿路上皮癌病理分級及患者臨床分期的關系 非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌（低級別）、非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌（高級別）及浸潤性尿路上皮癌中E-cad異常表達率分別為12.1%（4/33）、46.3%（19/41）、74.2%（23/31），3組的異常表達率有統(tǒng)計學差異（χ2=26.14，P＜0.01）；CD44v6異常表達率分別為24.2%（8/33）、61%（25/41）、90.3%（28/31），3組的異常表達率有統(tǒng)計學差異（χ2=56.76，P＜0.01）。E-cad在浸潤性（T2～T4）膀胱尿路上皮癌中的異常表達率[72.7%（24/33）]明顯高于淺表性（Ta～T1）膀胱尿路上皮癌[33.3%（24/72）]，兩組間異常表達率有統(tǒng)計學差異（χ2=28.97，P＜0.01）。CD44v6在浸潤性（T2～T4）膀胱尿路上皮癌中的異常表達率[87.9%（29/33）]明顯高于淺表性（Ta～T1）膀胱尿路上皮癌[45.8%（33/72）]，兩組間異常表達率有統(tǒng)計學差異（χ2=27.08，P＜0.01）。

MMP2在膀胱非浸潤乳頭狀尿路上皮癌（低級別）中陽性表達為24.2%（8/33），大部分基底膜呈強陽性，陽性表達較均勻；膀胱非浸潤乳頭狀尿路上皮癌（高級別）陽性表達為58.5%（24/41），基底膜陽性表達不均勻；膀胱浸潤性尿路上皮癌陽性表達為77.4%（24/31），腫瘤細胞表達強度不均勻，腫瘤間質陽性強度不均勻，與腫瘤細胞鄰接處表達較強，有統(tǒng)計學差異（χ2=53.62，P＜0.01）。Ta～T1為44.4%（32/72），T2～T4為72.7%（24/ 33），腫瘤細胞周圍間質呈強陽性，有統(tǒng)計學差異（χ2= 19.99，P＜0.01）。

2.3 E-cad、CD44v6和MMP2表達與患者預后的關系 80例獲隨訪患者，E-cad異常表達組5年生存率為67.4%（31/46），正常表達組91.2%（31/34）（P＜0.01）；CD44v6異常表達組5年生存率為68.9%（31/45），正常表達組88.6%（31/35）（P＜0.05）；MMP2陽性表達組5年生存率為70.4%（38/54），陰性組92.3%（24/26）（P＜0.05），其生存曲線見圖1-3。

圖1 E-cad異常表達與正常表達的膀胱尿路上皮癌患者生存曲線

3 討論

E-cad是一種介導細胞鈣黏附依賴性的跨膜糖蛋白，編碼基因定位于16q，它能與Ca2+特異性結合而發(fā)揮功能[1]。在腫瘤組織中的表達缺失或降低可導致腫瘤細胞間的黏附力降低,從而促使腫瘤細胞的脫落和轉移[2]。武玉東等[3]研究也證實了在膀胱尿路上皮癌中E-cad介導的細胞黏附能力減弱或消失。Shino等[4]報道在胃癌非腫瘤區(qū)E-cad表達正常，在未分化癌及轉移癌中E-cad表達異常。Ross等[5]報道膀胱癌E-cad表達減弱與腫瘤高分期和進展有關，非浸潤型尿路上皮癌與浸潤型尿路上皮癌相比后者E-cad表達明顯減弱。本組研究結果顯示，正常膀胱黏膜細胞膜著色均勻致密，說明細胞間黏附分子的定位及含量均正常，細胞間黏附性強，因而細胞不易脫落，尤其在細胞與細胞的連接部位更為明顯。隨著尿路上皮癌的分級和分期的增加細胞間的黏附性降低，E-cad的異常表達率亦明顯增加，這與文獻報道一致。

圖2 CD44v6異常表達與正常表達的膀胱尿路上皮癌患者生存曲線

圖3 MMP2陽性表達與陰性表達的膀胱尿路上皮癌患者生存曲線

CD44是一種穿膜糖蛋白，屬于細胞黏附分子家族成員，其中異構體CD44v6與腫瘤浸潤和轉移密切相關。Ross等[6]認為這與CD44v6在同型細胞間黏附作用有關，細胞-細胞，細胞-基質間黏附性的喪失可能會促使腫瘤逆分化及促進腫瘤細胞侵襲性，導致腫瘤的遠處轉移。本實驗提示：尿路上皮癌中CD44v6的表達與組織學分級有顯著相關性。腫瘤分化越差,CD44v6異常表達越明顯；細胞間的黏附力降低，侵襲能力增加，肌層浸潤及復發(fā)轉移率增加。因此，CD44v6的檢測將有助于尿路上皮癌的早期診斷和預后評估。

正常基底膜主要由Ⅳ型膠原等構成，為一致密的網(wǎng)狀結構，細胞不能自由通過。腫瘤細胞必須借助某些酶類，使基底膜成分有限降解形成小的孔隙并在其他有關因子的作用下完成穿透過程[7]。Bianco等[8]報道浸潤性尿路上皮癌MMP2表達強度明顯高于非浸潤性尿路上皮癌。本實驗亦顯示，MMP2在非浸潤性尿路上皮癌中的陽性表達率低于浸潤性尿路上皮癌，此結果說明腫瘤細胞本身分泌MMP2較多，且隨著腫瘤的分級增高其分泌增多，侵襲能力增強。有研究表明[9-10]，隨著病理分級和分期的增加MMP2表達顯著增強，提示MMP2陽性表達與尿路上皮癌的侵襲能力有關。本實驗中T2～T4期浸潤性膀胱尿路上皮癌中MMP2均為強陽性表達，陽性顆粒分布不均明顯高于Ta～T1，表明瘤細胞分泌MMP2在浸潤中起著關鍵作用。這提示在膀胱尿路上皮癌的進展和分化過程中，腫瘤分化程度越低,腫瘤細胞分泌MMP2越多,其浸潤和轉移的能力亦越強。MMP2的表達隨腫瘤分級增高而增強的同時,隨腫瘤分期的增高也相應增強,說明MMP2在基底膜降解、腫瘤侵襲和轉移過程中將起到更為重要的作用，也可作為判斷膀胱尿路上皮癌進展及預后的有效指標。

癌細胞能分泌一些蛋白酶，分解細胞基底膜，其中最主要的是金屬蛋白酶，癌細胞浸潤和轉移必須突破腺體、血管或淋巴管的基底膜進入間質或循環(huán)而達到浸潤和轉移的目的。膀胱尿路上皮癌多呈乳頭狀向腔內生長，黏附性差，易于脫落和復發(fā)。腫瘤切除后，在同一部位或不同部位再發(fā)，且其惡性程度往往比原發(fā)瘤更高、更具有侵襲性。其預后與腫瘤的浸潤深度和復發(fā)轉移的發(fā)生率密切相關。本文隨訪資料顯示E-cad、CD44v6異常表達組，5年生存率低于正常表達組；MMP2陽性表達組5年生存率顯著低于陰性組，提示E-cad、CD44v6的異常表達及MMP2陽性表達，有助于判斷膀胱腫瘤復發(fā)及預后，以便于臨床采取有效的治療措施。

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Expression of E-cadherin,CD44v6 and matrix metalloproteinase-2 in bladder urothelial carcinoma and its significance

Objective To investigate the expression of E-cadherin(E-cad),CD44v6 and matrix metalloproteinase-2 (MMP2)in bladder urothelial carcinoma and its clinical significance． Methods The expression of E-cad,CD44v6 and MMP2 was detected by mmunohistochemistry Envision method in 105 specimens of bladderurothelial carcinoma and 20 specimens of normal bladder tissue．Results E-cad and CD44v6 were positive and MMP2 was negative in all 20 specimens of normal bladder tissue．E-cad and CD44v6 were positively stained in 43．8%(46/105)and 58．1%（61/105）of bladder urothelial carcinoma specimens,respectively．The positive expression rate of MMP2 was 53．3%(56/105)．There was a positive correlation between the expression of E-cad and CD44v6．The abnormal expression rates of E-cad,CD44v6 and positive expression rate of MMP2 were significantly correlated with the pathologic grades,clinical stages,high recurrence rate and poor survival．Conclusion The expressions of E-cad,CD44v6 and MMP2 may be associated with malignant progression of bladder urothelial carcinoma and these proteins might be used as molecular markers for tumor progression,recurrence and prognosis．

E-cad CD44v6 MMP2 Bladder urothelial carcinoma

2013-01-29）

（本文編輯：田云鵬）

310022 杭州鋼鐵集團公司職工醫(yī)院病理科（周美玲）；浙江省人民醫(yī)院病理科（許勵、湯琪樂、徐文娟、茹國慶）

許勵，E-mail:xulizj@163.com