當(dāng)歸提取液對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

鄭益志 朱金土 賈麗瑩 曹毅 余土根

當(dāng)歸提取液對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

鄭益志 朱金土 賈麗瑩 曹毅 余土根

目的 研究當(dāng)歸提取液在體外誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞凋亡的作用及其可能的機(jī)制。 方法 采用MTT法檢測(cè)不同濃度當(dāng)歸提取液對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀FITC-Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)半胱天冬氨酸蛋白酶9（Caspase-9）活性的改變情況。 結(jié)果 濃度≥10mg/ml的當(dāng)歸提取液處理后HaCaT細(xì)胞增殖受到抑制，早期凋亡率顯著增高（均P＜0．01），細(xì)胞內(nèi)Caspase-9活性明顯增加（P＜0．05），均呈濃度依賴性。 結(jié)論 在一定濃度范圍內(nèi)，當(dāng)歸提取液可抑制誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡，Caspase-9活性增加可能是其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制之一。

當(dāng)歸提取液 HaCaT細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 Caspase-9

銀屑病是一種以角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖以及分化異常為特征的炎癥性皮膚病[1]。當(dāng)歸屬傘形科植物，性味甘、辛、溫，歸肝、心、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血、活血、調(diào)經(jīng)、止痛、潤(rùn)腸的功效。當(dāng)歸中包含揮發(fā)油、多糖、阿魏酸等多種化學(xué)成分[2]，臨床上作為常用中藥用于銀屑病靜止期和消退期治療，用以養(yǎng)血潤(rùn)膚，治療銀屑病取得明顯療效[3]，但關(guān)于當(dāng)歸抗角質(zhì)形成細(xì)胞增殖機(jī)制的相關(guān)研究開展不多。本研究以人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞為對(duì)象，觀察當(dāng)歸提取液對(duì)HaCaT細(xì)胞的影響，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 HaCaT細(xì)胞株（由浙江省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存），當(dāng)歸提取液（由浙江省中醫(yī)藥研究院提取），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Sigma），Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司，Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 藥物配置 取當(dāng)歸生藥10g，加入100ml蒸餾水濃煎至20ml，去渣取上清液，加入等體積的無(wú)水乙醇過(guò)夜，低溫超速4 000r/min離心10min，取上清液，水浴加熱以除去乙醇并濃縮至10ml，即濃度為1g/ml。濾膜除菌后分裝至1.5ml離心管，-80℃冰箱保存。使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋，濃度按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 HaCaT細(xì)胞以含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，每日換液，細(xì)胞單層鋪滿瓶底時(shí)傳代；將第3、4代HaCaT細(xì)胞以密度1×107/ml接種于1640培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 當(dāng)歸提取液對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml接種于96孔板，每孔200μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞80%融合后分別加入5、10、20、30mg/ml的當(dāng)歸提取液，正常對(duì)照組只加1 640培養(yǎng)液，每種濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，孵育24h后，每孔加入20μlMTT（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，每孔加入二甲亞砜150μl，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光度值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算增殖抑制率及IC50。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，調(diào)整至8×105/ml的密度，接種于6孔板，細(xì)胞80%融合后加入5、10、20、30mg/ml的當(dāng)歸提取液，繼續(xù)孵育24h，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，分別加入Annexin V-FITC 5μl和PI 10μl，室溫避光孵育15min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Caspase-9活性測(cè)定 96孔培養(yǎng)板內(nèi)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCat細(xì)胞加入不同濃度當(dāng)歸提取液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，胰酶消化細(xì)胞，每2×106個(gè)細(xì)胞加入100μl裂解液后，重懸細(xì)胞,冰浴裂解15min，離心，上清液移至預(yù)冷的離心管中，按說(shuō)明書的反應(yīng)體系加入相應(yīng)的試劑后混勻，37.4℃孵育60～120min，顏色變化明顯時(shí)即測(cè)定樣品中Caspase-9催化底物產(chǎn)生的吸光度值。

圖1 HaCaT細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（A：正常對(duì)照組；B：10mg/ml當(dāng)歸組；C：20mg/ml當(dāng)歸組；D：30mg/ml當(dāng)歸組）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，行單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)

2 結(jié)果

2.1 HaCaT細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察，正常HaCaT細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈多角形，境界清楚，排列緊密。5mg/ml當(dāng)歸處理組細(xì)胞生長(zhǎng)稍緩慢，與對(duì)照組相比形態(tài)無(wú)明顯差異，當(dāng)歸濃度≥10mg/ml時(shí)，細(xì)胞貼壁性顯著降低，間隙變大，部分細(xì)胞體積變小，與周圍的細(xì)胞脫離，細(xì)胞形態(tài)變圓或不規(guī)則，可見(jiàn)大量漂浮細(xì)胞。

HaCaT細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖1。

2.2 當(dāng)歸對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖抑制作用 MTT結(jié)果

顯示，5mg/ml當(dāng)歸組與正常對(duì)照組比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；當(dāng)歸提取液濃度為10mg/ml時(shí)吸光度值出現(xiàn)下降,與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；且隨著當(dāng)歸提取液濃度的增高下降顯著，各組與5mg/ml當(dāng)歸提取液組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 不同濃度當(dāng)歸對(duì)HaCat細(xì)胞增殖及凋亡率的影響

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HaCaT細(xì)胞凋亡 正常對(duì)照組、5、10、20、30mg/ml當(dāng)歸組細(xì)胞的凋亡率流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果分別為4.72%、5.08%、7.52%、14.96%、30.01%，5mg/ml當(dāng)歸組細(xì)胞凋亡率與正常對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），當(dāng)歸濃度≥10mg/ml的各組HaCaT細(xì)胞凋亡率明顯升高，與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)

計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.4 Caspase-9活性檢測(cè) 5mg/ml當(dāng)歸處理后，HaCaT細(xì)胞內(nèi)Caspase-9與正常對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯升高（P＞0.05）。而當(dāng)歸濃度≥10mg/ml的各組，吸光度值明顯升高，與正常對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），且與5mg/ml當(dāng)歸提取液組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01），見(jiàn)表2。

表2 不同濃度當(dāng)歸對(duì)HaCat細(xì)胞內(nèi)Caspase-9活性的影響

3 討論

銀屑病發(fā)病與細(xì)胞凋亡的關(guān)系逐漸受到越來(lái)越多學(xué)者的重視，已有研究發(fā)現(xiàn)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡增加與異常的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖活化密切相關(guān)，角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖與凋亡增加伴隨著銀屑病的發(fā)病[4-6]。因此，抑制細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)該病治療具有重要臨床意義。銀屑病的治療頗為棘手，到目前為止尚未開發(fā)出理想的治療藥物，近年來(lái),從中草藥中尋找新的治療藥物逐漸成為研究的熱點(diǎn)[7]。

于春水等[8]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖可通過(guò)阻止HaCaT細(xì)胞進(jìn)入S期而抑制其DNA合成，從而對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用,而當(dāng)歸提取液對(duì)HaCaT細(xì)胞的作用機(jī)制研究較少。本研究結(jié)果提示，當(dāng)歸提取液在低濃度(＜5mg/ml）對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用，達(dá)到一定濃度時(shí)（≥10mg/ml）對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖有明顯的抑制作用，且隨著濃度增加，抑制細(xì)胞增殖的能力也增加，抑制作用呈濃度依賴性。

細(xì)胞凋亡與許多生物學(xué)過(guò)程和疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。目前研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡主要經(jīng)過(guò)兩條通路[9]，由死亡受體途徑介導(dǎo)的外源性通路和線粒體途徑介導(dǎo)的內(nèi)源性通路，Caspase-9參與細(xì)胞凋亡的起始，是內(nèi)源性通路的關(guān)鍵酶。一些藥物可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減輕表皮增殖，改善皮損分化，而被廣泛應(yīng)用于銀屑病治療[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)從當(dāng)歸中提取的水溶性有效成分阿魏酸鈉能誘導(dǎo)人EBL-7404肝癌細(xì)胞的凋亡[12]，但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)不同濃度的當(dāng)歸提取液處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸提取液濃度≥10mg/ml時(shí)，能夠誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞株的早期凋亡，倒置相差顯微鏡下可觀察到明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，Annexin V-FITC雙染法也進(jìn)一步證實(shí)了當(dāng)歸誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，濃度≥10mg/ml當(dāng)歸提取液處理后，HaCaT細(xì)胞內(nèi)Caspase-9隨著濃度增加逐漸升高，且不同濃度的當(dāng)歸提取液組與正常對(duì)照組之間比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明當(dāng)歸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與激活內(nèi)源性凋亡途徑有關(guān)，并呈濃度依賴性。

總之，當(dāng)歸對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖抑制作用的機(jī)制尚不完全清楚。本研究顯示,當(dāng)歸提取液達(dá)到一定濃度（≥10mg/ml）對(duì)HaCaT細(xì)胞體外增殖有明顯的抑制作用，兩者呈量效關(guān)系。此外，當(dāng)歸提取液可通過(guò)Caspase-9介導(dǎo)的線粒體途徑內(nèi)源性通路促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡，其可能是當(dāng)歸治療銀屑病等角質(zhì)細(xì)胞增殖性皮膚病的作用機(jī)制。通過(guò)研究當(dāng)歸等中藥的抗角質(zhì)形成細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，將有利于開發(fā)更有效治療銀屑病的中藥制劑。

[1]Augustin M,Holland B,Dartsch D,et al．Adherence in the treatment of psoriasis:a systematic review[J]．Dermatology,2011,222 (4):363-374．

[2]歐陽(yáng)廣娜．當(dāng)歸藥效成分提取研究進(jìn)展[J]．實(shí)用中醫(yī)藥雜志,2011,27（8）:569-570．

[3]趙辯．中國(guó)臨床皮膚病學(xué)[M]．南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2010:1035．

[4] Haake A R,Polakowska R R．Cell death by apoptosis in epidermal biology[J]．Invest Dermatol,1993,101(2):107-112．

[5]倪曉,孫建方,楊海平,等．銀屑病皮損中細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)與bcl-2的表達(dá)[J]．中華皮膚科雜志,1998,31(2):95-96．

[6]Laporte M,Galand P,Fokan D,et al．Apoptosis in established and healing psoriasis[J]．Dermatology,2000,200(4):314-316．

[7] Kurd S K,Smith N,VanVoorhees A,et al．Oral curcumin in the treatment of moderate to severe psoriasis vulgaris:A prospective clinical trial[J]．J Am Acad Dermatol,2008,58(4):625-631．

[8]于春水,牟韻竹,蘇江維,等．當(dāng)歸多糖誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2010,9(3):143-145．

[9]Mollinedo F,Gajate C．Microtubules,microtubule-interfering agents and apoptosis[J]．Apoptosis,2003,8(5):413-450．

[10]Smit J V,de Jong E M,van Hooijdonk C A,et al．Systemic treatment of psoriatic patients with bexarotene decreases epidermal proliferation and parameters for inflammation,and improvesdifferentiationinlesionalskin[J]．AmAcadDermatol,2004, 51(2):257-264．

[11]McGill A,Frank A,Emmett N,et al．The anti-psoriatic drug anthralin accumulates in keratinocyte mitochondria,dissipates mito chondrial membrane potential,and induces apoptosis through a pathway dependent on respiratory competent mitochondria[J]．FASEB J,2005,19(8):1012-1014．

[12]朱秀琴,王國(guó)申,張學(xué)軍,等．中藥阿魏酸鈉對(duì)人EBL-7404肝癌細(xì)胞生存性及凋亡的影響[J]．世界華人消化雜志,1999,7(8):715．

Effects of angelica extracts on apoptosis of human keratinocytes and its mechanism

Angelica extracts HaCaT cells Apoptosis Caspase-9

2012-10-17）

（本文編輯：胥昀）

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2100759）

310006 杭州，浙江省中醫(yī)院皮膚科（鄭益志系浙江中醫(yī)藥大學(xué)博士研究生）

曹毅，E-mail：zrcstar@sina.cn

【 Abstract】Objective To investigate the effects of angelica extracts on the apoptosis of HaCaT cells and its mechanism．Methods MTT assay was used to observe the effects of different concentrations of angelica extracts on the proliferation of HaCaT cells．Apoptosis was evaluated by flow cytometry．The activity of caspase-9 was detected by fluorescent analysis．Results After treatment with angelica extracts(≥10mg/mL),the percentage of early apoptotic cells and the levels of caspase-9 activity in Ha-CaT cells were significantly increased．Conclusion Angelica extracts inhibits cell proliferation and induces apoptosis of HaCaT cells,which may be associated with the activation of caspase-9．