石蠟切片在中藥制片中注意事項(xiàng)及方法改良

★ 鄒江斌 盧建中 張娟娟 (江西中醫(yī)學(xué)院 南昌330004)

顯微鑒定是中藥材四大傳統(tǒng)鑒定方法之一。制作完整、均勻而薄的組織切片是確保科研工作者能夠準(zhǔn)確清晰看清組織構(gòu)造，從而辨別藥材真?zhèn)蔚那疤釛l件。石蠟切片具有簡單易行，切片效果好，可以永久保存，普遍藥材都適用等優(yōu)點(diǎn)從而被廣泛應(yīng)用。由于實(shí)驗(yàn)材料，試劑及方法等因素的影響，只要實(shí)驗(yàn)過程中某一過程處理不當(dāng)都可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，在實(shí)際操作中還得對實(shí)驗(yàn)各個(gè)環(huán)節(jié)加以注意。石蠟切片過程依次包括軟化(干硬藥材)、取材、固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋，切片，貼片與烤片、脫蠟、復(fù)水、染色、脫水、透明、封片等。本文總結(jié)了石蠟切片的某些過程的方法學(xué)改良和注意事項(xiàng)。

1 軟化

軟化是指對干、硬藥材的前處理。實(shí)際工作中由于季節(jié)及地域的限制，我們很難及時(shí)弄到新鮮藥材，因此我們常常采用干燥藥材，這時(shí)我們就要對藥材進(jìn)行軟化。對于一些硬度不是很大的藥材我們可以通過水浸泡，而對于藥材硬度較大的藥材就要通過其它方法處理。據(jù)宗希明［1］報(bào)道，部分干燥藥材采用適當(dāng)溶劑軟化可以得到良好效果。如一般質(zhì)地軟，含薄壁組織較多，木化組織較少的材料可選用15% －20%甘油、50% －70%乙醇、甘油－乙醇溶液、冰乙酸－乙醇溶液浸泡軟化。質(zhì)地硬，組織排列密度大，含纖維、石細(xì)胞、木栓化、木質(zhì)化組織較多的材料可選用15% －20%甘油、甘油－乙醇溶液、18%氨水溶液浸泡軟化。對于十分堅(jiān)硬，富含石細(xì)抱，纖維素性和木質(zhì)化的材料，可選用36%氨水溶液，置于溫箱中(30 －40℃)浸泡軟化。全部木栓化和本質(zhì)化的木材類，可用37%氫氟酸浸泡軟化。其后程蓮銀［2］舉了10 種有代表性的干硬藥材的軟化處理方法。婁玉霞［3］通過單因素考察發(fā)現(xiàn)軟化方法，軟化溫度，軟時(shí)間對藥材軟化效果存在影響。

2 取材

取材過程主要涉及到取材部位和取材大小。取材部位一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定，大小要適當(dāng):根及莖類一般直徑≤5mm，切取成5 －10mm 小段，對于稍粗藥材可以將其對剖成1/2或1/4 大小;葉類取過中脈處，與中脈成直角切成寬2 －5mm，長5 －8mm 小片。取材過大，固定液及石蠟難以進(jìn)入，同時(shí)水分也不易脫掉。

3 固定

對于新鮮藥材必須要經(jīng)過固定，其目的在于殺死及固定細(xì)胞，從而使組織保持原來的結(jié)構(gòu)。目前使用較多的為混合固定液:FAA 固定液、卡諾氏固定液、納瓦興氏固定液、波因固定液、里根規(guī)定液、酒精－福爾馬林液、鉻酸－醋酸固定液鉻酸、鉻酸－餓酸－醋酸固定液。其中FAA 固定液最為常用，由50%或者70% 酒精90mL、冰醋酸5mL 和福爾馬林5mL 配置而成［4］。由于它既可以作為固定液由可以用于保存藥材，因此固定時(shí)間沒有限制。固定液的體積應(yīng)為組織總體積的10 －15 倍［5］。

4 沖洗、脫水、透明及融蠟過程

固定之后，藥材應(yīng)置于流水中沖洗數(shù)小時(shí)，避免藥材中殘留的固定液直接影響染色效果。脫水過程是整個(gè)石蠟切片中最為重要的環(huán)節(jié)，藥材中水分是否被完全脫離直接影響到后面透明及融蠟過程中二甲苯及石蠟進(jìn)入，因此實(shí)驗(yàn)過程中要不定期更換脫水液以保證脫水液的濃度。脫水液一般從30%濃度開始，并且級別差盡量要小，避免藥材皺縮。同時(shí)我們要在脫水過程中注意控制脫水時(shí)間，否則會出現(xiàn)藥材過度硬化，直接影響后面的切片過程，每級脫水時(shí)間一般控制在10 －20 分鐘。如果當(dāng)天不能處理完脫水，透明過程，則放置70%乙醇中過夜。透明采取逐步加二甲苯法(1/2 無水乙醇+1/2 二甲苯、純二甲苯2 次)，透明要充分，直到完全透明為止，時(shí)間不可過長，否則材料易脆。融蠟過程時(shí)間較長，一般2 －3 天，期間我們要不停加入蠟屑，直至不在溶解為止，此過程在水浴鍋中進(jìn)行，溫度為40℃。然后將藥材取出放入已經(jīng)完全熔融的純蠟中2 次，每次時(shí)間為2 －3 小時(shí)，該過程在恒溫箱中進(jìn)行，溫度高于石蠟熔點(diǎn)1 －2℃。

據(jù)馬國祥等［6］研究發(fā)現(xiàn):利用聚乙二醇代替石蠟制石斛切片效果良好，解決了用石蠟切片時(shí)不足。徐珞珊等［7］利用加溫方法促使脫水、透明及石蠟過程在4 －5 小時(shí)完成。據(jù)報(bào)道［8］“生物快速處理儀”處理各級脫水、透明的時(shí)間只需15 －30 分鐘，可在較短的時(shí)間內(nèi)完成切片的全過程。

5 包埋

包埋前需要準(zhǔn)備好紙盒，其大小一般為5cm ×2cm ×1.5cm。將藥材連同熔融石蠟迅速從恒溫箱中取出倒入包埋盒中，用解剖針將藥材立于盒內(nèi)不倒再撤去。如果藥材周圍有氣泡存在，將解剖針放在酒精燈上灼燒片刻，迅速插向氣泡致其排出。如果想石蠟?zāi)苎杆倮鋮s，可以將紙盒放入冰水混合物中，同時(shí)可以防止壓塊中間凹陷出現(xiàn)空洞。鄧興峰［9］報(bào)道了石蠟切片法中細(xì)長或薄片狀材料的包埋方法:先在包埋紙盒底部形成約1mm 厚的軟蠟層;待軟蠟層凝固前，再向紙盒中倒?jié)M熔蠟，然后迅速將滲好蠟的材料直立地放入熔蠟中，并將材料輕壓在紙盒底部的軟蠟層上。

6 切片與粘片

切片時(shí)厚度的把握對能否形成連續(xù)蠟帶至關(guān)重要，一般控制在9 －10μm，太厚則切片容易卷縮，不能形成蠟帶。同時(shí)調(diào)整好刀片與蠟塊角度，一般刀刃與蠟塊表面呈5°，以保證切下來的藥材為橫切面，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。石蠟切片法中傳統(tǒng)的貼片方法主要有2 種:一種是用燙片臺法，一種是溫水撈取法。但是在但在少量切片時(shí)可直接在涂有甘油蛋白的載玻片上加少量蒸餾水，將切片放在上面，載玻片直接在酒精燈上加溫，至切片完全展開為止，倒去多余水分入溫箱中烤干。注意貼片位置為載玻片兩對角線交點(diǎn)處，以保證制片科學(xué)美觀。羅艷蕊等［10］通過實(shí)驗(yàn)，摸索得到一種快速，展片效果好的貼片方法:蠟帶在放入溫水之前，先放入事先配置好的濃度為45% －50%乙醇中片刻，然后再放入溫水中。以上貼片都在載玻片上涂有粘合劑，據(jù)任成林［11］經(jīng)驗(yàn)介紹不使用粘合劑同樣可以制作質(zhì)量穩(wěn)定，優(yōu)片率高的切片:其方法為一定要保證載玻片干凈，切片不要太厚，撈片時(shí)防止切片皺褶和含有氣泡，及時(shí)除去載玻片上水分，迅速放入橫溫箱中，橫溫箱的溫度應(yīng)高于所用石蠟熔點(diǎn)1 －2℃，烤片4 －6 小時(shí)。后來王寶榮等［12］人同樣報(bào)道了類似方法。

7 脫蠟與染色

切片染色時(shí)脫蠟一定要徹底，否則會導(dǎo)致不易著色，在同一切片上出現(xiàn)著色深淺不一。當(dāng)載玻片上無明顯蠟塊且清晰透明即可。如果想加快脫蠟時(shí)間，可以將二甲苯放在60℃恒溫箱中加溫30 分鐘。，然后再將烘好的切片放入二甲苯中，這樣不僅縮短了脫蠟時(shí)間，還降低了切片因脫蠟時(shí)間過長導(dǎo)致掉片［13］。通常藥材組織切片所用的染色劑為番紅(50%乙醇配置，濃度1%)，固綠或亮綠(乙醇配置，濃度0.5%)。番紅可以將木質(zhì)化組織染成紅色，快綠或亮綠可以將細(xì)胞壁染成綠色。番紅染色通常要24 小時(shí)以上，當(dāng)切片放置50%乙醇中洗脫，不完全褪色即可。固綠染色時(shí)間的把握對整體切片成敗起著決定性作用。染色時(shí)間太長，則組織會被染得太綠不利于觀察，如果太短，則組織著不上色，因此一般控制在30 －40 秒。染好的切片應(yīng)妥善保存，更應(yīng)避免日光照射，否則切片容易褪色。

8 中性樹膠封藏

切片封藏前要配置好中性樹膠，其方法為用二甲苯稀釋中性樹膠，用玻棒蘸取中性樹膠，當(dāng)樹膠成滴狀緩慢流下即可。封片時(shí)要注意不要產(chǎn)生氣泡，如果產(chǎn)生氣泡則用灼燒熾熱的解剖針從蓋玻片一側(cè)將氣泡引出。封好片后，放于37℃溫箱烘干，永久保存。

9 小結(jié)

常規(guī)的石蠟切片步驟并不復(fù)雜，但是想要做出一張優(yōu)秀的石蠟切片，需要我們在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制好每一環(huán)節(jié)，因?yàn)槠渲械拿恳粋€(gè)環(huán)節(jié)都是相互關(guān)聯(lián)、一環(huán)套一環(huán)的，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出錯，都會影響最終制片的質(zhì)量。同時(shí)我們還需要根據(jù)不同藥材，適當(dāng)改進(jìn)，從而才能得到我們所需要的切片。

［1］宗希明，韓樹盛.石蠟切片中干硬中藥材軟化處理方法［J］.佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，17(1):34 －35.

［2］程蓮銀.干、硬中藥材作石蠟切片的技術(shù)處理方法［J］. 中國藥師，2000，3(6):374.

［3］婁玉霞，蔣巧鳳.干燥中藥材石蠟制片的方法研究［J］.河南中醫(yī)藥學(xué)刊，1999，14(1):26 －27.

［4］李正理.植物制片學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，1973:9 －18.

［5］侯春春，徐水.淺析影響石蠟切片質(zhì)量的關(guān)鍵因素［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(23):94 －98.

［6］徐珞珊，馬國祥，陳世忠，等.聚乙二醇制作植物切片方法［J］.中國中藥雜志，1995，20(5):264 －265.

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［10］羅艷蕊，孔翔會，李衛(wèi)國，等.石蠟切片貼片法的改良［J］. 生物學(xué)雜志，2002，19(6):38.

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