益氣解毒中藥減少單純皰疹病毒性角膜炎復(fù)發(fā)的免疫機(jī)理研究

關(guān)瑞娟 亢澤峰 李 凌 何玉清 馬曉梅 張 蓉

單純皰疹病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis，HSK） 主要是由Ⅰ型單純皰疹病毒（herpes simplex virus typeⅠ，HSV-Ⅰ） 感染后在角膜引起的免疫病理性疾病〔1〕，由于其反復(fù)發(fā)作、病程遷延的特點(diǎn)，最終造成角膜混濁以致失明。目前尚無(wú)確切有效的藥物可以防止單純皰疹病毒性角膜炎復(fù)發(fā)。 亢澤峰〔2〕等曾對(duì)益氣解毒中藥抗HSK 復(fù)發(fā)進(jìn)行了臨床研究，結(jié)果表明：益氣解毒中藥能夠顯著延長(zhǎng)患者復(fù)發(fā)時(shí)間，縮短每次持續(xù)時(shí)間，具有良好的抗復(fù)發(fā)效應(yīng)。 為進(jìn)一步了解該藥抗HSK 復(fù)發(fā)的免疫學(xué)機(jī)理，我們對(duì)該藥治療前后患者的外周血T 淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行觀(guān)察與比較。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集復(fù)發(fā)性HSK 患者160 例（青海省人民醫(yī)院眼科門(mén)診、住院患者)，其中男88 例，女72 例，平均年齡（40.28±9.56）歲，復(fù)發(fā)次數(shù)最少2 次，最多10次。兩組在平均年齡、復(fù)發(fā)次數(shù)及持續(xù)時(shí)間上均有可比性（P＞0.05）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)與分型〔2〕

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)：①有感冒、發(fā)熱或特定的發(fā)病誘因，反復(fù)發(fā)作。②角膜知覺(jué)減退，結(jié)膜充血。③角膜混濁，呈樹(shù)枝狀、地圖狀或盤(pán)狀改變。④熒光素角膜染色陽(yáng)性。

1.2.2 分型：納入研究的患者分為：上皮型角膜炎；非壞死性角膜基質(zhì)炎；樹(shù)枝狀角膜潰瘍。

1.2.3 納入標(biāo)準(zhǔn)〔1〕：①年齡在16～65 歲的患者，男女不限；②符合HSK 診斷標(biāo)準(zhǔn)；③HSK 活動(dòng)期患者在進(jìn)入研究前至少?gòu)?fù)發(fā)2 次以上者； ④患有復(fù)發(fā)性HSK 并經(jīng)兩名研究者獨(dú)立診斷的患者。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn)〔3〕：排除壞死性基質(zhì)型角膜炎、細(xì)菌性角膜炎、真菌性角膜炎等其他感染性角膜炎等。

1.2.5 復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)畏光、流淚、眼痛，角膜上皮缺損呈點(diǎn)狀、樹(shù)枝狀或地圖狀，或角膜基質(zhì)水腫、混濁，角膜熒光素染色陽(yáng)性，角膜知覺(jué)減退等。排除細(xì)菌性角膜炎、真菌性角膜炎等其它感染性角膜炎，即診斷為HSK 復(fù)發(fā)。

1.3 方法

1.3.1 所有患者在急性期觀(guān)察臨床總有效率和平均住院日，治療有效者繼續(xù)原治療達(dá)到臨床治愈，并對(duì)患者隨訪(fǎng)1 年，觀(guān)察復(fù)發(fā)情況（失訪(fǎng)率＜20%），3 例無(wú)效患者進(jìn)行住院或轉(zhuǎn)院治療。

1.3.2 主要試劑：r-INF、IL-18 檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；0.15%更昔洛韋眼用凝膠(湖北科益藥業(yè)有限公司)；黃芪桂枝口服液(青海省人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào)：青制字：2000 第Z-0286）。

1.3.3 給藥方法：治療組：生黃芪，炒白術(shù)，防風(fēng)，桂枝，蒲公英，金銀花，密蒙花，蟬蛻，決明子，生姜2片，紅棗1 枚，每日1 劑，水煎服，分2 次服用，14 天為1 個(gè)療程。共服藥2 個(gè)療程；同時(shí)給予0.15%更昔洛韋眼用凝膠點(diǎn)眼，每日3 次。有基質(zhì)水腫時(shí)給予妥布霉素地塞米松滴眼液（ALCON）點(diǎn)眼，每日4 次。伴房水閃輝時(shí)給予復(fù)方托吡卡胺散瞳。 用藥前后監(jiān)測(cè)肝腎功能，未出現(xiàn)不良反應(yīng)。 對(duì)照組：0.15%更昔洛韋眼用凝膠點(diǎn)眼，每日3 次，有基質(zhì)水腫時(shí)給予妥布霉素地塞米松滴眼液點(diǎn)眼，每日4 次。 伴房水閃輝時(shí)給予復(fù)方托吡卡胺散瞳。

1.4 T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)過(guò)程：青海省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

兩組患者均在治療前后抽取外周靜脈血約3 ml，加肝素（20 μ/ml）抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液制備淋巴細(xì)胞懸液，采用間接免疫熒光染色后再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T 細(xì)胞亞群。 取已制備的淋巴懸液各100 ml，分別加入100 μl 抗CD3、CD4、CD8（鼠抗人）單克隆抗體（Murine Monoclonal Antibody）。 混勻、避光、室溫孵育30 min，加入l ∶200 稀釋的二抗(羊抗鼠Ig-FITC）100 μl 室溫孵育30 min，最后加PBS 液2 ml 上機(jī)檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)中用PBS 液分別代替一抗、二抗作陰性對(duì)照。 每份樣本檢測(cè)10 000 個(gè)經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)熒光標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞。 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)所有患者治療前后外周血T 淋巴細(xì)胞亞群比例。

1.5 細(xì)胞因子（IL-18、IFN-γ）檢測(cè)過(guò)程（青海省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科完成）

1.5.1 標(biāo)本的采集：選用EDTA 作為抗凝劑，標(biāo)本采集后將標(biāo)本放于-20 ℃或-80 ℃保存，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)提前30 分鐘取出標(biāo)本，置于2～8 ℃自然解凍，1 000 r/min，離心15 分鐘，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1.5.2 操作步驟：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，提前配置好所有試劑，混勻時(shí)盡量避免起泡。 設(shè)置好0.01 pg/ml，50 pg/ml，100 pg/ml，250 pg/ml，500 pg/ml，1 000 pg/ml 六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品；①加樣；②甩干；③溫育60 min 后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次；④每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液）100 μl，37 ℃，溫育60 分鐘；⑤棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。 ⑥顯色；⑦依序終止反應(yīng)；⑧測(cè)光密度（OD 值）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，配對(duì)資料采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效比較（表1～2）

失訪(fǎng)14 例，失訪(fǎng)率＜20%。 失訪(fǎng)原因：青海幅員遼闊，部分患者家住偏遠(yuǎn)地區(qū)，交通不便，痊愈后未能復(fù)查并且沒(méi)有電話(huà)。

表1 兩組HSK 患者1 年內(nèi)復(fù)發(fā)情況比較（眼數(shù)/只，%）

表2 HSK 治愈患者第1 次復(fù)發(fā)平均時(shí)間（天）比較（眼數(shù)/只，x±s）

表3 兩組HSK 治愈患者治療前后1 年內(nèi)復(fù)發(fā)頻次比較（眼數(shù)/只，x±s）

2.2 治療前、后T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

表4 HSK 患者治療組與對(duì)照組治療前后CD3、CD4 及CD8 比較（x±s）

由表1～3 可看出，黃芪桂枝口服液可明顯降低患者的復(fù)發(fā)率、縮短患者每次復(fù)發(fā)的平均天數(shù)。 從表4 可見(jiàn)：治療組治療前、后相比T 淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD4/CD8 升高，CD8 下降（P＜0.05）；對(duì)照組：治療前后相比CD3、CD4、CD4/CD8 淋巴細(xì)胞無(wú)明顯變化，CD8 降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 治療前后黃芪桂枝口服液對(duì)T 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響

表5 黃芪桂枝口服液治療前后細(xì)胞因子比較（x±s）

3 討論

根據(jù)中醫(yī)“久病致虛，虛易受邪”理論，結(jié)合HSK的發(fā)病特點(diǎn)，我們認(rèn)為HSK 反復(fù)發(fā)作的主要病因是伏邪內(nèi)傷，新感即發(fā)，病機(jī)特點(diǎn)為氣虛邪留，邪毒內(nèi)伏，關(guān)鍵環(huán)節(jié)為“虛”、“毒”，是在邪侵正虛的基礎(chǔ)上，演變?yōu)檎撔皯俚幕セ贾畡?shì)，以其病、證結(jié)合病位，進(jìn)行辨證論治，以“扶正祛邪”為治則、“益氣托毒”為治法遣方用藥。 方中黃芪、炒白術(shù)健脾益氣、托毒外出補(bǔ)后天；合防風(fēng)固衛(wèi)表而御外邪；入桂枝調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，助陽(yáng)制寒；銀花、紫草、蒲公英增清解之力，重在托毒祛邪，以達(dá)“正氣存內(nèi)，邪不可干”之效。

目前治療HSK 最常用的藥物是阿昔洛韋、更昔洛韋、細(xì)胞因子、手術(shù)治療與基因疫苗學(xué)治療。 多年來(lái)的臨床和實(shí)驗(yàn)研究均表明，機(jī)體免疫功能低下是誘使病毒活化、產(chǎn)生復(fù)發(fā)的重要原因〔6，7〕，單純采用抗病毒藥物治療，雖然能起到抑制病毒復(fù)制、控制當(dāng)時(shí)發(fā)作的作用，但因不能徹底清除殘留在眼部或潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)的病毒，一旦遇到過(guò)勞、感冒等機(jī)體免疫功能低下或應(yīng)用皮質(zhì)類(lèi)固醇藥物等情況時(shí)仍可復(fù)發(fā)。 因此抗復(fù)發(fā)不僅要抑制潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)HSV-1 再活化，更要重視提高機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)自身抗病毒及清除病毒能力，而益氣扶正中藥有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用〔8，9〕。

大多數(shù)研究結(jié)果表明〔10〕：HSK 復(fù)發(fā)的主要免疫介質(zhì)是CD4+T 淋巴細(xì)胞及其分泌的相關(guān)因子。 Th1所產(chǎn)生的IFN-γ 和IL-18 等細(xì)胞因子主宰細(xì)胞免疫〔11〕。 IL-18 是一種炎性細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生〔12〕，參與了多種炎性反應(yīng)性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，在免疫反應(yīng)過(guò)程中它促進(jìn)Th1細(xì)胞的活性并促進(jìn)Th1細(xì)胞合成和分泌IFNγ〔13〕。 IFN-γ 是由Th1型細(xì)胞分泌的，具有廣譜抗病毒活性，通過(guò)人體免疫細(xì)胞的細(xì)胞酶效應(yīng),誘發(fā)出多種抗病毒蛋白,調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能抑制病毒復(fù)制與繁殖。有研究結(jié)果表明：IFN-γ 在角膜感染的免疫應(yīng)答全過(guò)程中均有表達(dá)〔14〕，這有助于抵御HSK 的復(fù)發(fā)感染。 本研究通過(guò)觀(guān)察治療前后T 淋巴細(xì)胞的變化及其分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-18 的變化來(lái)闡明黃芪桂枝口服液抗HSK 復(fù)發(fā)的作用機(jī)理。

本研究結(jié)果表明：黃芪桂枝口服液可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力來(lái)起作用，主要是通過(guò)激活CD4+淋巴細(xì)胞的活性，促進(jìn)體內(nèi)IL-18 的分泌，誘導(dǎo)抗病毒因子IFN-γ 的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)CD+TH1細(xì)胞的免疫應(yīng)答、提高機(jī)體的免疫功能、非特異性的阻抑眼部潛伏的HSV-1 再活化，從而降低HSK 的復(fù)發(fā)。

黃芪桂枝口服液之所以有較好的抗復(fù)發(fā)作用，就在于本方具有清熱解毒以祛邪治標(biāo)，益氣固表以扶本護(hù)目，祛邪與扶正同施，標(biāo)本兼治的作用，充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥“祛邪扶正”防治HSK 復(fù)發(fā)的基本學(xué)術(shù)觀(guān)點(diǎn)。 在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)角膜上皮炎治療效果明顯，而角膜潰瘍后期會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜上皮病變，推測(cè)本方對(duì)此可能也有一定的治療作用，這將在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。在進(jìn)行免疫學(xué)研究時(shí)未能將淺層型與深層性角膜病變分別研究并且對(duì)照分析，針對(duì)存在的這些問(wèn)題，我們將會(huì)在今后的研究中予以注意并加以區(qū)分。

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