不同石榴品種果實成熟期酚類物質(zhì)組分與含量分析

韓玲玲　苑兆和　馮立娟　楊尚尚　朱峰

摘 要： 【目的】為了揭示不同石榴品種成熟期果實酚類物質(zhì)組分與含量的差異，【方法】以‘水晶甜、‘紅寶石和‘綠寶石3個不同果色表現(xiàn)型（白皮、紅皮、綠皮）石榴品種為試材，利用高效液相色譜法（HPLC）分別測定其果皮、種子和果汁中酚類物質(zhì)的組分與含量?！窘Y(jié)果】各石榴品種果皮和種子中共檢測到13種酚類物質(zhì)，果汁中檢測到12種，未檢測到表兒茶素。不同品種同一部位酚類物質(zhì)含量差異顯著，在果皮、種子和果汁中‘綠寶石石榴多酚含量最高，‘水晶甜果皮和果汁中多酚含量最低，‘紅寶石種子中多酚含量最低。各石榴品種不同部位多酚的總量均是果皮（5.957 mg·g-1）最高，主要成分為對羥基苯甲酸、表兒茶素和兒茶素；果汁（1.037 mg·g-1）次之，主要成分為兒茶素和對羥基苯甲酸；種子（0.295 mg·g-1）含量最低，主要成分為根皮苷和兒茶素?！窘Y(jié)論】石榴不同品種不同部位酚類物質(zhì)含量存在顯著差異。

關(guān)鍵詞： 石榴； 品種； 多酚； 高效液相色譜

中圖分類號：S665.4 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0099-06

石榴（Punica granatum L.）屬石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）植物，主要分布在西亞、印度、以色列和西班牙等國家。目前，我國石榴產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已經(jīng)成為世界上種植面積最大的國家[1]。石榴自古以來就是一種藥食兩用的植物，其果實營養(yǎng)價值較高，是一種中高檔水果?，F(xiàn)代科學研究表明，石榴果實提取物具有很強的抗氧化性，對心腦血管疾病、某些腫瘤、細菌感染等具有顯著的防治作用，這些功能可能是源自于石榴果實所含的多酚類物質(zhì)[2-5]。

多酚是植物體內(nèi)最重要的次生代謝產(chǎn)物之一，主要存在于植物的皮、根、葉、果中[6]。在日本有人將其稱之為繼第6類營養(yǎng)素膳食纖維之后的第7類營養(yǎng)素[7]。據(jù)研究，石榴中多酚的含量較高，具有很高的食用價值和藥用價值[8]。目前，關(guān)于石榴多酚的研究主要集中在石榴多酚的提取物[9]、總多酚含量的測定[10]等方面，且大都局限于單一品種。利用高效液相色譜法測定石榴酚類物質(zhì)含量的研究較少[11]，對石榴不同品種、不同部位酚類物質(zhì)組分及含量測定方面的研究尚未見相關(guān)報道。本試驗以自主選育的3個石榴品種為試材，采用高效液相色譜法對其果實不同部位酚類物質(zhì)組分與含量進行深入研究，以揭示不同石榴品種成熟期酚類物質(zhì)組分與含量的差異，為石榴酚類物質(zhì)的開發(fā)利用和良種選育提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試劑與設(shè)備

多酚標準品：沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、表兒茶素、咖啡酸、兒茶素、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、槲皮素、肉桂酸、根皮素，純度≥98%，天津一方科技有限公司生產(chǎn)。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（分析純）、冰乙酸（分析純），天津永大試劑責任有限公司生產(chǎn)。

Waters 510高效液相色譜儀（美國Waters 公司生產(chǎn)） ，配有Waters 2487雙波長紫外檢測器。ALPHA1-4真空冷凍干燥機（德國CHRTST公司生產(chǎn)）。PHS-2C實驗室pH計（上海偉業(yè)儀器廠生產(chǎn)）。5810R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司生產(chǎn)）。RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)）。

1.2 材料

試驗于2011年9—12月在山東省果樹研究所進行。供試材料為紅皮的‘紅寶石、綠皮的‘綠寶石和白皮的‘水晶甜3個石榴品種，定植于山東省果樹研究所石榴種質(zhì)資源圃，該資源圃石榴立地條件中等，管理水平一般，一年施用1次基肥，樹齡均為8 a生。采用完全隨機設(shè)計，各品種分別選取9株樹，3次重復，3株為一小區(qū)。取樣時，選取樹勢一致的植株，自樹體東南西北4個方向及高度一致的果枝取完全成熟的果實。采摘后低溫條件下帶回實驗室，將果皮和籽粒分開，籽粒手工壓榨后經(jīng)3層紗布過濾得到果汁，榨汁后剩下的部分去掉假種皮得到種子。果皮、果汁和種子分離后冷凍干燥，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 石榴樣品的處理方法 取冷凍干燥后的果皮1.0 g，磨碎加入10 mL超純水，用1 mol·L-1 NaoH調(diào)pH至7.0，加入10 mL的乙酸乙酯，在搖床上搖動15 min，4 ℃ 5 000 r·min-1離心15 min，分離出酯相和水相，水相再用上述方法萃取2次，合并酯相，此為中性酚。水相用6 mol·L-1的HCl調(diào)pH至2.0，再分別用10 mL的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，此為酸性酚。將中性酚和酸性酚合并后真空濃縮至干，殘渣溶于4 mL的甲醇中，0.22 μm濾膜過濾，放入-20 ℃冰箱中冷藏保存、備用。

種子和果汁中多酚的提取同上。

1.3.2 多酚標準溶液的配置 分別準確的秤取6.0 mg沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、表兒茶素、咖啡酸、兒茶素、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、槲皮素、肉桂酸、根皮素，用甲醇分別定容至10 mL得每個標準品的標準溶液。分別移取5.0 mL，混合定容至100 mL得13種標準品混合液。標準品溶液不使用時放4 ℃冰箱中保存。

1.3.3 多酚的測定方法 色譜柱為Kromasil 色譜柱（ 250 mm×4.6 mm， 5 μm ），柱溫30 ℃，檢測器為Waters 2487雙波長紫外檢測器，波長280 nm，流動相為乙腈（A液）和1%冰乙酸水溶液（B液），線性梯度洗脫，流速為1.1 ml·min-1。梯度洗脫程序：0 ～30 min（10%～35%A液，65%～90% B液），30～40 min （35% A液，65% B液），40～42 min，（35%～10% A液，65%～90% B液），42～45 min，（10% A液，90% B液） 。

1.4 分析方法

采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準品的測定

在確定的色譜條件下，取10 μL標準品混合液進樣分析，得到其標準溶液的分離色譜圖（圖1）。沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、表兒茶素、咖啡酸、兒茶素、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、槲皮素、肉桂酸和根皮素的保留時間分別為3.398、7.915、9.348、10.165、10.765、12.565、15.132、17.098、21.832、 22.932、25.165、31.032、33.765 min，且各標準品的峰形和分離效果均較好。

2.2 石榴果實酚類物質(zhì)的組分與含量測定

2.2.1 石榴果皮中酚類物質(zhì)的組分與含量差異 在確定的色譜條件下，分別取10 μL不同品種果皮多酚提取液進樣，得到不同石榴品種果皮酚類物質(zhì)色譜圖（圖2），將圖2與圖1比較，根據(jù)保留時間確定各石榴品種果皮中所含的酚類物質(zhì)的組分。從圖2可以看出，3個石榴品種的果皮中均檢測到了13種酚類物質(zhì)。

不同石榴品種果皮中酚類物質(zhì)含量存在一定的差異（表1），‘綠寶石果皮中酚類物質(zhì)總量（6.774 mg·g-1）顯著高于‘紅寶石（5.897 mg·g-1）和‘水晶甜（5.199 mg·g-1）。檢測到的酚類物質(zhì)中，對羥基苯甲酸、表兒茶素和兒茶素含量較高，在‘水晶甜果皮中合計占56.19%，高于‘紅寶石（49.23%）和‘綠寶石（44.74%）。根皮素含量最低，在果皮中僅占0.19%～0.27%。沒食子酸和香草醛在‘紅寶石果皮中含量最高，‘水晶甜中最低。綠原酸、咖啡酸、苯甲酸和槲皮素的含量在‘綠寶石果皮中最高，‘水晶甜中最低。阿魏酸和根皮苷含量在‘綠寶石果皮中最高，‘紅寶石中最低。‘水晶甜果皮中肉桂酸含量最高 （0.090 mg·g-1），‘綠寶石中含量最低（0.077 mg·g-1）?？梢姡煌衿贩N果皮中各酚類物質(zhì)含量不同。

2.2.2 石榴種子中酚類物質(zhì)組分與含量差異 如圖3所示，3個石榴品種的種子中亦均檢測到了沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、表兒茶素、咖啡酸、兒茶素、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、槲皮素、肉桂酸和根皮素這13種酚類物質(zhì)。

石榴種子中的酚類物質(zhì)含量明顯低于石榴果皮，各品種種子中所含的酚類物質(zhì)含量仍然存在較大的差異（表2）?！G寶石含有的酚類物質(zhì)總量（0.312 mg·g-1）顯著高于‘水晶甜（0.290 mg·g-1）和‘紅寶石（0.283 mg·g-1）。檢測出的酚類物質(zhì)中，根皮苷和兒茶素的含量較高，在‘水晶甜中合計占了42.13%，高于‘紅寶石 （41.77%）和‘綠寶石 （35.88%）。香草醛和綠原酸在各石榴品種中含量均最低，僅占多酚總量的3.38%～4.07%。各品種種子中的沒食子酸和對羥基苯甲酸含量由高到低依次為‘綠寶石、‘紅寶石和‘水晶甜。‘綠寶石中表兒茶素、咖啡酸、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸的含量最高，其次為‘水晶甜和‘紅寶石，其中‘綠寶石中的含量是‘紅寶石的1.5倍?！t寶石中槲皮素和根皮素的含量最高?？梢?，不同石榴品種種子中各酚類物質(zhì)含量不同。

2.2.3 石榴果汁中酚類物質(zhì)的組分與含量差異 如圖4所示，3個石榴品種的果汁中同樣也檢測到了沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、兒茶素、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、槲皮素、肉桂酸和根皮素，但未檢測到表兒茶素。

由表3可知，各石榴品種果汁中所含的酚類物質(zhì)含量差異顯著，其中‘綠寶石含有的總量（1.402 mg·g-1）顯著多于‘紅寶石（1.117 mg·g-1）和‘水晶甜（0.592 mg·g-1）。兒茶素在‘綠寶石和‘紅寶石中的含量均最高，分別為0.422 mg·g-1和0.289 mg·g-1，‘水晶甜中對羥基苯甲酸含量最高為0.086 mg·g-1；阿魏酸在‘綠寶石和‘水晶甜中含量最低，分別為0.023 mg·g-1和0.011 mg·g-1，‘紅寶石中槲皮素含量最低（0.004 mg·g-1），僅占總多酚含量的0.32%。‘綠寶石中沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、香草醛和肉桂酸的含量均高于‘紅寶石和 ‘水晶甜；苯甲酸和根皮苷的含量以‘紅寶石中的最高；‘水晶甜中根皮素含量高于其他品種?？梢?，石榴果汁中各酚類物質(zhì)的含量因石榴品種的不同而不同。

2.2.4 石榴果實不同部位酚類物質(zhì)的組分及含量差異 綜合比較表1～3可以看出，石榴果皮、果汁和種子酚類物質(zhì)含量存在顯著差異。各石榴品種不同部位酚類物質(zhì)的總量均是果皮（5.957 mg·g-1）>果汁（1.037 mg·g-1）>種子（0.295 mg·g-1），‘水晶甜、‘紅寶石和‘綠寶石果皮酚類物質(zhì)總量分別比種子高94.41%，95.19%和95.39%。除了‘水晶甜中的阿魏酸和根皮苷，‘綠寶石中的根皮苷，‘紅寶石中的槲皮素的含量為果皮>種子>果汁，各品種根皮素的含量在果汁中最高外，各石榴品種不同部位沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、兒茶素、香草醛、苯甲酸和肉桂酸的含量均是果皮含量最高，果汁次之，種子中的含量最低。表兒茶素在果汁中未檢測出來，果皮中的含量顯著高于種子?？梢?，石榴果實不同部位酚類物質(zhì)組分與含量存在顯著差異。

3 討 論

大量的研究證實：兒茶素和表兒茶素具有抗氧化性、抗腫瘤、抗過敏及抑菌抗病毒等多種生物學功能[12]。本研究發(fā)現(xiàn)：各石榴品種所含酚類物質(zhì)中，兒茶素和表兒茶素為主要成分，平均含量分別為1.241， 1.055 mg·g-1，這與在棗[13]、杏[14]等水果中的研究一致。由此推測，石榴果實具有抗衰老、抗肝炎和抗前列腺癌等多種保健功能可能與這2種物質(zhì)有關(guān)。Poyrazoglu等[15]研究認為，沒食子酸和兒茶素是石榴汁中主要的酚類物質(zhì)。李國秀[16]對石榴果實不同部位酚類物質(zhì)研究指出，安石榴苷、沒食子酸和表兒茶素為主要的酚類物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸的含量較高，而沒食子酸的含量則較低，這可能由于石榴果實品種、成熟度和組織形態(tài)不同使所含的成分不同。

石榴作為藥源植物，酚類物質(zhì)的組成及含量是評價其質(zhì)量的重要指標。對于水果，酚類物質(zhì)也是評價其果實風味和品質(zhì)的重要指標。本試驗結(jié)果表明，同一品種不同部位，酚類物質(zhì)組分和含量不完全相同，表兒茶素在果皮和種子含量較高，而在果汁中未檢測出來。酚類物質(zhì)總量是果皮中的含量最高，果汁次之，種子含量最少，這種器官上的差異與胡淳淳等[17]的研究結(jié)果一致。Mousavinejad等[18]、胡芳等[19]研究認為不同石榴品種，酚類物質(zhì)的組分和含量不同，本試驗進一步證實該觀點，果皮和果汁中酚類物質(zhì)總量‘綠寶石的顯著高于‘紅寶石和‘水晶甜，種子中酚類物質(zhì)總量由高到低依次為‘綠寶石、‘水晶甜和‘紅寶石。石榴多酚具有明顯的品種和器官差異性，該結(jié)果有利于加深人們對石榴果實各部分營養(yǎng)價值的認識，為石榴的育種工作和綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

果皮的顏色與花青苷、葉綠素、類胡蘿卜素和類黃酮等色素類物質(zhì)含量有關(guān)，同時還受酚類等次生代謝物質(zhì)的影響[20]。本文采用高效液相色譜法對紅、綠、白3種果色表現(xiàn)型石榴品種多酚組分及含量進行研究，各品種石榴果皮多酚含量差異顯著。供試品種中，果實成熟時‘紅寶石果皮全紅，‘綠寶石果皮僅向陽面稍有紅色斑點，但‘綠寶石果皮多酚含量較‘紅寶石高，這可能是由于果實成熟時多酚與花青苷的合成途徑幾乎同時存在，二者的合成均以苯丙氨酸為直接前體，合成過程相互制約?！鸸麑嵆墒鞎r呈黃白色，多酚含量最低，其原因尚不清楚。關(guān)于多酚和花青苷的代謝、轉(zhuǎn)化過程與果實色澤的關(guān)系還有待進一步的研究。

參考文獻 References：

[1] LI Bao-yin. Pomegranate[M]. Beijing： China Forestry Publishing House， 2004： 1-12.

李保印. 石榴[M]. 北京： 中國林業(yè)出版社， 2004： 1-12.

[2] YUAN Zhao-he， YIN Yan-lei， ZHU Li-qin， LI Yun， HOU Le-feng. Research progress on neutraceutical functions of pomegranate [J]. Shandong Forestry Science and Technology， 2008（1）： 91-93.

苑兆和， 尹燕雷， 朱麗琴， 李云， 侯樂峰. 石榴保健功能研究進展[J] . 山東林業(yè)科技， 2008（1）： 91-93.

[3] GIL M I，TOMAS-BARBERAN F A，HESS-PIERCE B. Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and processing[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2000， 48（10）： 4581-4589.

[4] ADAMS L S， SEERAM N P， AGGARWAL B B. Pomegranate Juice， total pomegranate ellagitannins， and punicalagin suppress inflammatory cell signaling in colon cancer cells[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（3）： 980-985.

[5] AVIRAM M， DORNFELD L. Pomegranate juice consumption inhibits serum angiotensin converting enzyme activity and reduces systolic blood pressure[J]. Atherosclerosis， 2001，158（1）： 195-198.

[6] SHI Bi， DI Ying. Plant polyphenol[M]. Beijing： Science Press，2000：19-20.

石碧，狄瑩. 植物多酚[M]. 北京： 科學出版社，2000： 9-12.

[7] LING Guan-ting. Polyphenols are called as “Seventh Nutrients”[J]. China Food Additives，2000 （1）： 28-37.

凌關(guān)庭. 有“第七類營養(yǎng)素”之稱的多酚類物質(zhì)[J]. 中國食品添加劑，2000（1）： 28-37.

[8] WANG Zhi-yuan， LI Qing-biao， YANG Cui-xian， SHAO Wen-yao， HE Ning， WANG Yuan-peng， SUN Dao-hua. Polyphenol contents in eight fruits and their antioxidant activities[J]. Nat Prod Res Dev. 2007， 19： 1040-1043， 1023.

[9] LI Yun-feng. Studies on the extraction， antioxidant and anti-antherogenic activities of antioxidants from pomegranate peel[D]. Beijing： China Academy of Military Medical Science，2004.

李云峰. 石榴皮抗氧化物質(zhì)提取及其抗氧化、抗動脈僵硬化作用研究[D]. 北京： 軍事醫(yī)學科學院，2004.

[10] TIAN Shu-ge， WEI Yu-long， LIU Hong-bing. Determination of total polyphenol in the different places of Punica Granatum L by Folin-Ciocalteu colorimetry[J]. Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory，2009， 26（2）： 340-344.

田樹革，魏玉龍，劉宏炳. Folin-Ciocalteu比色法測定石榴不同部位總多酚的含量[J].光譜實驗室，2009， 26（2）： 340-344.

[11] LI Jian-ke， LI Guo-xiu， ZHAO Yan-hong， YU Chao-zhou. Composition of pomegranate peel polyphenols and its antioxidant activities[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2009，42（11）： 4035-4041.

李建科， 李國秀， 趙艷紅， 余朝舟. 石榴皮多酚組成分析及其抗氧化活性[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2009，42（11）： 4035-4041.

[12] CUI Zhi-jie， HE Ling， LIU Zhong-hua， FAN Zhi-yong， ZHANG Shi-rui， WANG Chao-ran， YI Yu， ZHANG Yun-qian. Catechin： biological activity and application potential[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2011，23（10）： 1664-1668.

崔志杰， 何玲， 劉仲華， 范志勇，張石蕊，王超然，易玉，張云倩. 兒茶素的生物學活性及其應(yīng)用前景概述[J]. 動物營養(yǎng)學報， 2011，23（10）： 1664-1668.

[13] NIAN Hong-li， LI Hao， CAO Dong-dong， CAO Jian-kang， JIANG Wei-bo. Determination of phenolic compounds in jujube peels at different maturity stages by high performance liquid chromatography [J]. Journal of Beijing Forestry University，2011，33（1）： 139-143.

念紅麗， 李赫， 曹冬冬， 曹建康，姜微波. 高效液相色譜測定不同成熟期棗皮酚類物質(zhì)[J].北京林業(yè)大學學報， 2011，33（1）： 139-143.

[14] CI Zhi-juan， CHEN Xue-sen， ZHANG Li-jie， LIANG Qing， ZHANG Chun-yu，LIU Xiao-li. Preliminary study on the mechanism of enzymatic browning in apricot fruits[J]. Shandong Agricultural Sciences，2006（6）： 17-19， 25.

慈志娟， 陳學森， 張立杰， 梁青， 張春雨，劉曉麗. 杏果實酶促褐變機理的研究初報[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學， 2006（6）： 17-19， 25.

[15] POYRAZOGLU E， GOKMENW V， ARTIK N. Organic acids and phenolic compound in pomegranates （Punica granatum L.） grown in Turkey[J]. Journal of Food Composition and Analysis，2002（15）： 567 -575.

[16] LI Guo-xiu. Separation and identification of polyphenols in pomegranate fruit and its antioxidant activities[D]. Xian： Shaanxi Normal University， 2008.

李國秀. 石榴多酚類物質(zhì)的分離鑒定和抗氧化活性研究[D]. 西安： 陜西師范大學， 2008.

[17] HU Chun-chun， SHAO Jian-zhu， XU Ji-zhong， YANG Xiao-yu. Comparison of polyphenols contents in different organs of different pomegranate cultivars[J]. Journal of Agricultural University of Hebei， 2010，33（2）： 17-20.

胡淳淳， 邵建柱， 徐繼忠， 楊曉玉. 不同石榴品種及器官多酚含量的比較研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報， 2010，33（2）： 17-20.

[18] MOUSAVINEJAD G， EMAM-DJOMEH Z， REZAEI K， KHODAPARAST M H S H. Identification and quantification of phenolic compounds and their effects on antioxidant activity in pomegranate juices of eight Iranian cultivars[J]. Food Chemistry， 2009，115（2009）： 1274-1278.

[19] HU Fang， ZHAO Zhi-hui， LIU Meng-jun. The determination of betulic acid， oleanic acid and ursolic acid in different Chinese jujube cultivars by HPLC[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2011， 27（05）： 434-438.

胡芳， 趙智慧， 劉孟軍. HPLC法測定不同棗品種果實中白樺酯酸、齊墩果酸和熊果酸含量[J]. 中國農(nóng)學通報， 2011，27（05）： 434-438.

[20] ZHANG Yuan-hui， GUAN Jun-feng， YANG Jian-min， ZHAO Shu-tang. Study on the changes of contents of pigments， total phenolics， sugars and polyphenol oxidase （PPO） activity in the fruit skin of plum cultivars during fruit development[J]. Journal of Fruit Science， 2004，21（1）： 17-20.

張元慧， 關(guān)軍鋒， 楊建民， 趙樹堂. 李果實發(fā)育過程中果皮色素、糖和總酚含量及多酚氧化酶活性的變化[J]. 果樹學報， 2004，2（1）： 17- 20.