臍橙精油氧化還原性對油胞下陷病害的影響

汪源　劉永忠　彭抒昂　胡先文

摘 要： 【目的】為了探索臍橙果皮精油氧化還原性與柑橘果實油胞下陷病害的關(guān)系，【方法】以奉節(jié)臍橙為試材，對奉節(jié)臍橙正常和油胞下陷病發(fā)生較嚴(yán)重的果實在病變過程中果皮精油的pH、維生素C含量、活性氧產(chǎn)生速率及抗氧化活性的變化情況進(jìn)行了分析。【結(jié)果】結(jié)果表明，在整個貯藏過程中，奉節(jié)臍橙果皮油胞下陷病發(fā)生率和果皮精油pH隨貯藏時間的增加而上升，外皮組織中溢出的精油的氧化性使病變率顯著增加；正常果的果皮精油產(chǎn)生活性氧速率低于癥狀果，但抗氧化活性和維生素C含量高于癥狀果?！窘Y(jié)論】說明奉節(jié)臍橙精油氧化還原性是果皮油胞下陷病害的影響因素。

關(guān)鍵詞： 臍橙； 油胞下陷； 精油； 活性氧； 抗氧化活性

中圖分類號：S666.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0094-05

重慶市奉節(jié)縣是我國柑橘的優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)，但當(dāng)?shù)鬲毺氐耐寥罋夂驐l件也使柑橘易發(fā)生油胞下陷病，嚴(yán)重影響了柑橘果實的外觀，大幅度降低了果實的商品性能。柑橘油胞下陷?。ㄓ纸杏桶卟?、油胞病、油胞凹陷，英文名為Oil Spotting，Oleocellosis）是柑橘產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的生理性病害[1-2]，在果實成熟期和采后貯藏期間發(fā)病較為嚴(yán)重，使果皮表面形成不規(guī)則的淺綠色或黃色、褐色病斑。病斑內(nèi)油胞明顯突出破裂，油胞間組織凹陷，進(jìn)而出現(xiàn)萎縮形成病狀。由于油胞枯萎主要發(fā)生在柑橘的黃皮層，所以油胞下陷病一般不會引起果實腐爛，但病斑易受青霉、綠霉菌侵染而導(dǎo)致果實變味腐爛，嚴(yán)重影響果實的外觀和商品性，導(dǎo)致其在市場上的售價遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于沒有患油胞下陷的果實，給我國柑橘種植戶造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重制約了我國柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

柑橘油胞下陷長期不太受人關(guān)注，國內(nèi)外近年來的相關(guān)研究報道很少。有研究發(fā)現(xiàn)，柑橘油胞下陷病的發(fā)生與外部環(huán)境條件有著密切的關(guān)系[3-6]。如由于氣候變化如降雨、干旱或灌溉等原因，柑橘園土壤質(zhì)地、土壤肥力、植株營養(yǎng)水平和植株呼吸速率降低時，果實水份代謝失調(diào)，易導(dǎo)致該病的發(fā)生。Shomer等[7]研究發(fā)現(xiàn)，滲到橘皮下表層組織的橘油阻礙了葉綠素向成色素細(xì)胞的分化而發(fā)生病變。在病斑的形成與褐變過程中，細(xì)胞壁的破裂變形及氧化酶如PPO（多酚氧化酶）、CAT（過氧化氫酶）等也起到了重要的作用[8]。Sawamura等[9]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘外皮組織中的油胞破裂后滲出的具有光毒性的橘油對果皮造成了傷害。油胞的橘油釋放壓和流出橘油毒性的大小與內(nèi)源激素GA3[10]和乙烯[11]等也有關(guān)。另外，較強的陽光直射和果面高溫容易引起外果皮組織受損[12]，以及機械損傷在果皮上造成傷口，油胞中滲出的橘皮精油會使病斑進(jìn)一步擴大。以前的研究多是關(guān)注如何通過控制采前條件來控制果實的病害，而事實上，即使采用健康的果實貯藏，在貯藏期依然會發(fā)生比較嚴(yán)重的油胞下陷病。目前，對柑橘果皮精油抗菌性研究較多，但對于果皮精油引起柑橘油胞下陷病及其氧化還原性與油胞下陷病的關(guān)系的研究少見報道。我們以‘奉節(jié)臍橙為試驗材料，用外源精油處理臍橙，研究經(jīng)處理后臍橙油胞下陷的發(fā)生狀況及在貯藏過程中果皮精油活性氧的產(chǎn)生速率及病變過程中抗氧化指標(biāo)的變化情況，以探索外源精油氧化還原性對臍橙果皮油胞下陷病的影響，為有效防治油胞下陷提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

‘奉節(jié)臍橙（Citrus sinensis Osbeck）果實采于奉節(jié)縣一商業(yè)園，挑選新鮮無機械損傷，大小均一，成熟度一致的果實進(jìn)行分裝處理，于適宜溫度和濕度條件下貯藏。

1.2 方法

1.2.1 臍橙果皮精油的制備 根據(jù)Sawamura等[13]介紹的方法，稍做修改，具體方法為：將新鮮的正常臍橙果皮削去白皮層，放入5%左右的石灰水中浸泡8～16 h后，取出、洗凈。用雙手手指一點一點彎折外果皮使油泡破裂，讓精油射出，置于含飽和氯化鈉溶液的玻璃離心管管口的漏斗進(jìn)入離心管中（離心管放于冰浴里），用高速離心機在5 000 r·min-1下離心10 min，用吸管吸出上層液，加入無水硫酸鈉脫水，于5 ℃冰箱中放置過夜（注意保存），于5000 r·min-1下再離心10 min ，得冷壓精油A，用同樣的方法提取發(fā)生癥狀的臍橙果皮精油B。

1.2.2 臍橙果皮精油處理‘奉節(jié)臍橙果實 將無癥狀的、無機械損傷、大小均一、成熟度一致的果實洗果晾干后，進(jìn)行以下各種處理：（1）將臍橙精油滴加到水果包裝紙上，然后將其包裝臍橙；（2）直接將臍橙精油涂抹于臍橙果實表面；（3）用2%的維生素C處理后將臍橙精油涂抹于果實表面；（4）不做任何處理。4種方式每處理50個，處理后分別用厚度為0.02 mm的聚乙烯袋單果包裝，將其儲藏于4℃冰箱中。每周統(tǒng)計果皮油胞下陷病害的發(fā)生情況，3次重復(fù)。參照Knight等[8]的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分級及計算。油胞下陷級別：0為無；1為較輕微；2為輕微；3為中等；4為嚴(yán)重。

油胞下陷指數(shù)=∑（塌陷級別×該級別果實占總果實的百分比）

1.2.3 臍橙果皮精油pH的測定 在室溫下（16～25 ℃）用pH計對上述制備好的2種臍橙精油分別進(jìn)行測定，取3次結(jié)果的平均值，測定范圍為0～14，每周定期測定pH值并觀察顏色變化情況。

1.2.4 臍橙果皮精油活性氧產(chǎn)生速率的測定 參照王愛國等[14]的方法并加以改進(jìn)。取1.0 mL冷壓精油加入磷酸緩沖液（pH 7.8）1.0 mL和10 mmol·L-1鹽酸羥胺0.1 mL，在25 ℃混合并培養(yǎng)20 min。取0.5 mL培養(yǎng)液依次加入0.5 mL 17 mmol·L-1對氨基苯磺酸和0.5 mL 7 mmol·L-1 α-萘胺，在25 ℃反應(yīng)20 min，反應(yīng)后的顯色液用同體積正丁醇充分搖勻，離心分層，取正丁醇相在412 nm處測定樣品吸光值，用磷酸緩沖液代替樣品作空白。樣品重復(fù)測定3次，每周定期測定1次。活性氧產(chǎn)生速率以μmol·g-1·min-1表示。

1.2.5 臍橙果皮精油維生素C含量的測定

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線。用鉬藍(lán)比色法測定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 取7支25 mL容量瓶，依次加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、l.20 mL 維生素C標(biāo)準(zhǔn)液（1 g·L-1），然后加草酸-EDTA溶液10.00、9.80、9.60、9.40、9.20、9.00、8.80 mL，最后各管分別加入1.00 mL偏磷酸-醋酸，3.00 mL 6%硫酸，3.00 mL 6%鉬酸銨溶液。放置10 min顯色穩(wěn)定后，用1號空白為參比于840 nm波長下測OD。以維生素C含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線方程y=0.014x-0.004。

2）維生素C含量的測定。取精油1.00 mL于25 mL容量瓶中，依次加入9.00 mL草酸-EDTA溶液，1.00 mL偏磷酸-醋酸溶液，3.00 mL 6%硫酸，3.00 mL 6%鉬酸銨溶液，顯色，以蒸餾水為參比，于840 nm波長下測OD。每周定期測定1次， 每次重復(fù)3次。

1.2.6 臍橙果皮精油抗氧化活性的測定 采用DPPH·清除能力來確定抗氧化效果[15]。稱取DPPH·試劑0.2561 g，無水乙醇溶解，轉(zhuǎn)入1 000 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻得濃度為256.1 mg·L-1 DPPH·儲備液（約6.5×104 mol·L-1 [16]），置于冰箱中冷藏備用，使用前用無水乙醇稀釋至濃度為25.61 mg·L-1。在最大波長516 nm，按表1加樣測定各吸光值（A）。每一吸光度平行測3次，取其平均值，每24 h測定1次，清除率按下式計算：DPPH·自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖；應(yīng)用SPSS11.5軟件對數(shù)據(jù)差異顯著性進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著。完成果皮油胞病害發(fā)生率與精油氧化還原性的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臍橙果皮精油處理后對臍橙果皮油胞病害發(fā)生率的影響

由圖1可知，臍橙果實經(jīng)果皮精油不同方法處理后，直接涂抹精油的果實發(fā)生油胞下陷病害的比例顯著大于其他處理的臍橙果實，貯藏的臍橙果皮油胞下陷指數(shù)隨貯藏時間而緩慢增加。直接涂抹精油的臍橙在后期貯藏時（至56 d）果皮油胞下陷指數(shù)增加到接近4.00，高于其他方式處理的貯藏果實（P<0.05），而其他方式處理的則分別為3.61、3.35和3.06。另外，用維生素C處理過后涂抹精油的臍橙與未涂抹精油的臍橙在前14 d發(fā)生油胞下陷的指數(shù)非常接近（至14 d時分別為1.76和1.68），并無顯著差異（P>0.05），但從第21天開始出現(xiàn)差別，此時維生素C慢慢失去抗氧化作用，往后逐漸加重，至第8周時，維生素C處理過的果皮油胞下陷指數(shù)增加到3.35，4者之間顯著性差異（P<0.05），但相較于處理方式1與2，用維生素C處理過涂抹精油后的臍橙發(fā)生油胞下陷的時間及程度均都有所降低，說明維生素C的抗氧化作用處理能降低油胞下陷的發(fā)生。

2.2 臍橙果皮精油pH 變化情況

由表2可知，通過對精油pH值的測定，發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時期的延長，pH值在緩慢的逐漸增大，在第49天時，2者的pH值分別達(dá)到了6.12和6.34，2者的pH值變化在貯藏期間并無顯著差異（P>0.05）。而2種精油的顏色隨著貯藏時間的增加也在逐步的加深，至第49天時分別變?yōu)樽攸S色和棕色，癥狀果精油的顏色更深，且隨著時間的增加，其pH值仍在不斷增加。

2.3 臍橙果皮精油活性氧產(chǎn)生速率的變化

由圖2可知，癥狀果和正常果采后貯藏期間活性氧產(chǎn)生速率均有一高峰，之后逐漸呈下降趨勢。剛開始幾周活性氧產(chǎn)生速率較快，癥狀果在第28天活性氧產(chǎn)生速率達(dá)到了0.93 μmol·g-1·min-1，比正常果升高了4.5%，而正常果產(chǎn)生活性氧速率上升緩慢，至第35天時，活性氧產(chǎn)生速率為0.89 μmol·g-1·min-1。在前28 d，癥狀果產(chǎn)生活性氧速率明顯高于正常果，且呈上升趨勢，從第35天開始，活性氧產(chǎn)生速率逐漸下降，并且2者差異不顯著（P>0.05）。在整個貯藏期間，2種果皮精油活性氧產(chǎn)生速率無顯著性差異（P>0.05）。

2.4 臍橙果皮精油維生素C含量變化

由圖3可知，果皮精油中維生素C含量非常低，且隨時間增加而逐漸降低，貯藏期間正常臍橙果皮精油維生素C含量顯著高于癥狀果皮精油維生素C 含量（P<0.05），2種果實在貯藏過程中，果皮精油維生素C含量在不斷的下降，正常臍橙果皮精油在貯藏前的維生素C含量為23.4 mg·L-1，比癥狀臍橙果皮精油在貯藏前的維生素C含量高10.38%，臍橙果實在貯藏49 d后，果皮精油維生素C含量急劇下降，分別下降了82.05%，83.96%。隨著時間的增加，仍然有繼續(xù)下降的趨勢。

2.5 臍橙果皮精油的抗氧化活性

結(jié)果表明，2種臍橙果皮精油對DPPH自由基有一定的清除能力，正常果皮精油清除DPPH能力顯著高于癥狀果（P<0.01），2者的清除率在第7天時分別為74.39%和68.46%，表明其具有一定的抗氧化活性；且正常臍橙果皮精油的抗氧化活性明顯高于發(fā)生癥狀的（P<0.05）。實驗結(jié)果同時發(fā)現(xiàn)，橘皮精油的抗氧化活性表現(xiàn)出隨著放置時間的增加而逐漸下降，放置21 d后，其對DPPH·的清除率分別下降了8.8%和15.8%，隨著精油存放時間的延長，其抗氧化能力還在不斷的下降（圖4）。

3 討 論

臍橙果實經(jīng)果皮精油處理后，油胞下陷發(fā)生率明顯增加，說明精油可誘導(dǎo)臍橙油胞下陷病害的發(fā)生。分析認(rèn)為果皮精油誘導(dǎo)后，引起了果皮細(xì)胞代謝紊亂，造成了果皮組織的膜脂過氧化和脫酯化作用[16-18]，致使病害發(fā)生。分析認(rèn)為，由于臍橙精油暴露在空氣中極易被氧化，在精油的氧化過程中對果皮油胞造成了不同程度的傷害，從而誘導(dǎo)了油胞下陷的發(fā)生。臍橙果皮精油氧化還原性會導(dǎo)致果實油胞下陷病發(fā)生，精油活性氧產(chǎn)生速率及抗氧化活性的變化為這一機理提供了依據(jù)。但對于橘油誘導(dǎo)油胞下陷病的機制還需要進(jìn)一步研究。

臍橙果實采后在貯藏過程中正常果和油胞果的油胞病害發(fā)生率與活性氧、維生素C含量等都密切相關(guān)。正常果皮精油維生素C含量、抗氧化活性明顯高于癥狀果；果皮油胞下陷病害的程度隨著活性氧的增加而逐漸的加重。因機體在正常的生命過程中伴有活性氧自由基的產(chǎn)生，根據(jù)活性氧自由基傷害學(xué)說，在正常生理條件下，植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧不足可使植物受到傷害，如果活性氧的產(chǎn)生加快，而清除系統(tǒng)的功能降低，就會使活性氧在體內(nèi)積累。隨著時間的變化，果實體內(nèi)氧化代謝發(fā)生變化，果實的抗病能力改變，導(dǎo)致病變發(fā)生。此外，這可能與氧化性爆發(fā)（oxidative burst）有關(guān)，即果皮組織或細(xì)胞在受到病菌或誘病因子的誘導(dǎo)下能在一定的時間內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，使細(xì)胞中活性氧的水平比正常高2～5倍，這些活性氧具有強氧化性，使果皮受到傷害，從而更易發(fā)生病變。

橘皮精油具有一定的抗氧化能力，但隨著精油存放時間的延長，其抗氧化能力有下降的趨勢。而由果皮提取的臍橙精油經(jīng)科學(xué)鑒定主要含有D-檸檬烯，它在植物抗氧化中起關(guān)鍵作用。然而D-檸檬烯是一種不穩(wěn)定的有機物，在光照和水分的影響下，它能自動氧化成香芹酮、香芹醇及一系列雜質(zhì)，從而慢慢失去了抗氧化的作用。本研究結(jié)果表明，果皮精油的氧化破壞是導(dǎo)致臍橙發(fā)生油胞下陷的重要原因之一。因而，在本實驗條件下控制精油的氧化破壞，可以顯著降低臍橙果實油胞下陷的發(fā)生。

4 結(jié) 論

臍橙果皮精油對臍橙果實油胞下陷發(fā)生率及發(fā)生程度均有顯著影響，同時果皮精油具有一定的抗氧化能力，且其抗氧化性活性隨放置時間的延長而逐漸降低，精油的氧化還原性對油胞下陷的發(fā)生產(chǎn)生影響。同時正常果與癥狀果精油的維生素C含量、活性氧產(chǎn)生速率呈顯著性差異。也證實了果皮精油的抗氧化性影響著油胞下陷的發(fā)生。

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