不同蘋(píng)果砧木組培苗抗旱性的比較研究

張靜　趙亮明　鄒志榮

摘 要： 【目的】為了提供蘋(píng)果耐旱育種及栽培材料，【方法】以5種蘋(píng)果砧木組培苗為試材，PEG-6000作為脅迫劑，模擬室外干旱進(jìn)行處理，運(yùn)用模糊隸屬函數(shù)抗旱性綜合分析，比較了5個(gè)蘋(píng)果砧木組培苗的耐旱性?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，在PEG-6000脅迫條件下，不同蘋(píng)果砧木的葉綠素含量總體均呈下降趨勢(shì)，葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量隨PEG-6000脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高逐漸升高。在整個(gè)脅迫過(guò)程中，各蘋(píng)果砧木組培苗葉片內(nèi)蛋白質(zhì)含量隨脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增大。SOD活性隨PEG-6000脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈先升高后下降趨勢(shì)，且在20%PEG-6000脅迫條件下SOD活性達(dá)到了最大。POD活性隨脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。【結(jié)論】5種蘋(píng)果砧木的抗旱性順序依次為：新疆野蘋(píng)果>平邑甜茶>八棱海棠>‘M26>‘M9。

關(guān)鍵詞： 蘋(píng)果砧木組培苗； PEG-6000脅迫； 抗旱性評(píng)價(jià)

中圖分類(lèi)號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪01-0088-06

蘋(píng)果是世界上栽培的主要果樹(shù)，也是我國(guó)果樹(shù)栽培中面積最大的樹(shù)種。干旱是影響苗木成活與生長(zhǎng)的重要限制因子[1]，也是一種影響植物生產(chǎn)最普遍的環(huán)境脅迫[2]，更是導(dǎo)致減產(chǎn)最嚴(yán)重的環(huán)境脅迫[3]。全球范圍內(nèi)因干旱導(dǎo)致的作物產(chǎn)量損失超過(guò)其他環(huán)境脅迫造成減產(chǎn)總和[4]，2005年巴西干旱缺水，導(dǎo)致巴西全國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)量直接減少35%[5]。因此選育抗旱性強(qiáng)的蘋(píng)果砧木，用于維持蘋(píng)果產(chǎn)量與品質(zhì)、擴(kuò)大栽培面積一直是干旱地區(qū)果樹(shù)栽培的主要任務(wù)[6]。蘋(píng)果樹(shù)常規(guī)育種周期長(zhǎng)，占地面積大，限制了耐旱性品種的選育與篩選。前人對(duì)蘋(píng)果種質(zhì)資源的抗旱性研究已為抗旱蘋(píng)果品種的選育提供了很多理論依據(jù)[7]，但蘋(píng)果砧木的抗旱性鑒定仍存在不少問(wèn)題，例如：（1）對(duì)蘋(píng)果矮化砧木和喬化砧木的抗旱性沒(méi)有比較研究；（2）對(duì)品種的抗旱性鑒定花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。而植物組織培養(yǎng)可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段或篩選基因突變體來(lái)縮短培育周期，有利于果樹(shù)樹(shù)種的選育。迄今國(guó)內(nèi)外有關(guān)蘋(píng)果組培苗抗旱性研究的相關(guān)報(bào)道較少，僅趙軍營(yíng)[8]對(duì)‘嘎拉蘋(píng)果進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究。本研究首先在材料選擇上選取了矮化砧木‘M9、‘M26和喬化砧木八棱海棠、平邑甜茶、新疆野蘋(píng)果進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)利用這些材料的組培苗作為試材，通過(guò)研究其對(duì)PEG-6000脅迫的反應(yīng)，從而建立高效的蘋(píng)果幼苗抗旱性早期鑒定技術(shù)體系，為蘋(píng)果抗旱無(wú)性系篩選及資源鑒定提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2009年3月于西北農(nóng)林科技大學(xué)蘋(píng)果示范基地進(jìn)行，以‘M9、‘M26、八棱海棠（M. micromalus Mak.）、平邑甜茶（M. hupehensis Rehd.）和新疆野蘋(píng)果[M. sieversii （Ledeb） Roem.]5個(gè)蘋(píng)果屬樹(shù)種的1 a生枝條為試材。將上述材料置于27 ℃溫室內(nèi)水培，每升水中加入1/8MS和5 g蔗糖，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)，每5 d換水1次[9-10]。待芽長(zhǎng)至1.5～2.0 cm 時(shí)，剪取嫩芽去掉大葉，在自來(lái)水下沖洗3～4 h，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒10 s，結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%升汞消毒8 min后，用含50 mg·L-1抗壞血酸的無(wú)菌溶液沖洗3～4次莖尖后[11]，接種到MS+6-BA1.0 mg·L-1 +NAA0.1 mg·L-1附加500 mg聚乙烯吡咯烷酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待新芽長(zhǎng)出后，切取新芽接入繼代培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基加6-BA0.5～1.0 mg·L-1，IBA0～0.5 mg·L-1）中增殖。每瓶?jī)?nèi)接3～4個(gè)芽，光照12～14 h·d-1、光照強(qiáng)度2 000 lx，25 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2 方法

不同材料的脅迫培養(yǎng)基為繼代培養(yǎng)基附加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG-6000，分別為 0 （CK）、10% （B1）、15% （B2）、20% （B3）、25%（B4），共5水平，重復(fù)3次。在無(wú)菌條件下將培養(yǎng)到第4 代的不同蘋(píng)果砧木組培苗修剪成1.0 cm左右?guī)ы斞康那o段，接種于設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基上，每個(gè)品種每一處理各接種20瓶，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光照時(shí)間為12 h /d，光照強(qiáng)度為2000 lx，培養(yǎng)溫度為 23～27 ℃， 相對(duì)濕度為50%～70%。培養(yǎng)30 d后進(jìn)行不同指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

葉綠素含量和電導(dǎo)率的測(cè)定參照劉世鵬[12]的方法。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白（Pr）含量均參照孫群等[13]的方法測(cè)定。

1.4 蘋(píng)果砧木抗旱性評(píng)定

植物抗旱性強(qiáng)弱受多種因子影響，通常用單一指標(biāo)無(wú)法正確的評(píng)定，因此本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行隸屬函數(shù)[14]分析，對(duì)5種蘋(píng)果砧木的抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從而比較各品種的抗旱性強(qiáng)弱。其計(jì)算公式如下：

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SA8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Duncans新復(fù)極差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG-6000脅迫對(duì)苗葉綠素含量的影響

葉綠素是反映光合作用強(qiáng)度的重要指標(biāo)，在干旱脅迫條件下，抗旱性越強(qiáng)，葉綠素含量下降的幅度越小。由表1可知，隨著PEG-6000脅迫程度的加重，各砧木葉片的葉綠素含量總體上均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且葉綠素降低程度因品種差異而表現(xiàn)不同。在25% PEG處理下‘M9、‘M26、八棱海棠、平邑甜茶、新疆野蘋(píng)果的相對(duì)葉綠素含量與對(duì)照相比分別下降了45.64%、52.01%、34.58%、12.07%、7.20%。由此可知，平邑甜茶和新疆野蘋(píng)果的葉綠素含量下降幅度小。且除平邑甜茶在P< 0.05水平上，對(duì)照與B1及B2差異不顯著外，其他品種各質(zhì)量分?jǐn)?shù)間均表現(xiàn)差異顯著。

2.2 PEG-6000脅迫對(duì)葉片可溶性蛋白的影響

蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，含量的多少直接反映植物的生長(zhǎng)狀況，含量越多抗旱性越強(qiáng)。由表2可知，5個(gè)供試蘋(píng)果砧木的對(duì)照與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG-6000脅迫處理下可溶性蛋白含量差異顯著。在整個(gè)脅迫過(guò)程中，各蘋(píng)果砧木葉片內(nèi)蛋白質(zhì)含量隨脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增大，在B4條件下，‘M9、‘M26、八棱海棠、平邑甜茶和新疆野蘋(píng)果葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量也達(dá)到了最大，與對(duì)照處理相比可溶性蛋白質(zhì)含量分別增加了38.75%、63.45%、49.94%、102.78%、122.93%。

2.3 PEG-6000脅迫對(duì)葉片質(zhì)膜相對(duì)透性的影響

電導(dǎo)率的大小直接反應(yīng)植物的抗逆性，值越大，抗性越弱。從表3可以看出，不同蘋(píng)果砧木葉片的相對(duì)電導(dǎo)率隨PEG-6000脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而逐漸升高，且葉片質(zhì)膜的相對(duì)透性增加幅度各不相同。各蘋(píng)果砧木的相對(duì)電導(dǎo)率，在各質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理與對(duì)照處理相比差異均顯著。在B4質(zhì)量分?jǐn)?shù)脅迫處理下，‘M9、‘M26、八棱海棠、平邑甜茶和新疆野蘋(píng)果的相對(duì)電導(dǎo)率與對(duì)照處理相比增加幅度依次為14.431%、11.891%、10.332%、7.790%、7.865%。由此可知新疆野蘋(píng)果和平邑甜茶的抗旱性較‘M9、‘M26、八棱海棠的強(qiáng)。

2.4 PEG-6000脅迫對(duì)葉片SOD、POD活性的影響

超氧化物岐化酶（SOD）是植物保護(hù)系統(tǒng)中的主要保護(hù)酶，在此系統(tǒng)中處于核心地位，它的活力與植物的抗性關(guān)系密切。過(guò)氧化物酶（POD）能清除體內(nèi)過(guò)多H2O2等過(guò)氧化物，是細(xì)胞內(nèi)防御酶系統(tǒng)中體內(nèi)自由基的清除劑。隨著干旱脅迫的加劇，不同植物體表現(xiàn)出得活性不同。由表4可以看出，SOD活性隨PEG-6000脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高表現(xiàn)為先升高后下降，各處理間差異均顯著。在B3條件下‘M9、‘M26、八棱海棠、平邑甜茶和新疆野蘋(píng)果的SOD活性均最高，分別是對(duì)照的1.22、1.15、1.23、1.24和1.78倍。

從表5可看出，不同蘋(píng)果砧木POD活性變化隨處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈逐漸升高的趨勢(shì)。在脅迫處理后的30 d，與對(duì)照相比，B4處理POD活性分別提高了： ‘M9 1.376倍，‘M26 1.347倍，八棱海棠1.572倍，平邑甜茶1.425倍，新疆野蘋(píng)果1.393倍。方差分析表明，5個(gè)供試蘋(píng)果砧木的POD活性對(duì)照與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG-6000脅迫處理差異顯著。在P< 0.05水平上，除新疆野蘋(píng)果CK與B1不顯著外，其他品種的砧木均表現(xiàn)為差異顯著。

2.5 PEG-6000脅迫對(duì)葉片丙二醛（MDA）含量的影響

丙二醛是膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量多少可以直接反映植物受害程度。干旱脅迫越嚴(yán)重，MDA含量越大，植物的抗旱性越弱。從表6可知，PEG-6000脅迫過(guò)程中，5種蘋(píng)果砧木的丙二醛含量隨著脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高均有所增加， 5個(gè)供試蘋(píng)果砧木的MDA含量在對(duì)照與處理間差異均顯著，在B4處理下，與其對(duì)照相比，各砧木丙二醛含量增加量依次為‘M9 4.357 mmol·g-1、‘M26 3.688 mmol·g-1、八棱海棠3.417 mmol·g-1、平邑甜茶2.582 mmol·g-1、新疆野蘋(píng)果3.389 mmol·g-1。

2.6 蘋(píng)果砧木組培苗抗旱性綜合評(píng)價(jià)

本研究以不同脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)下各指標(biāo)平均值的隸屬函數(shù)加權(quán)平均值作為品種抗旱性的綜合評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，這樣消除了個(gè)別指標(biāo)帶來(lái)的片面性，使各品種抗旱性差異具有可比性。平均隸屬值越大抗旱性越強(qiáng)。由表7可以知，新疆野蘋(píng)果的隸屬值最大，表明其抗旱性最強(qiáng)，而‘M9的隸屬值最小，則抗旱性最弱。由此得出這幾種蘋(píng)果砧木的抗旱性依次為：新疆野蘋(píng)果>平邑甜茶>八棱海棠>‘M26>‘M9。

為了進(jìn)一步研究6個(gè)蘋(píng)果砧木抗旱性指標(biāo)間的協(xié)同變異程度， 對(duì)上述材料的SOD、POD活性，可溶性蛋白（Pr）含量，丙二醛（MDA）含量，葉片相對(duì)電導(dǎo)率（REC），葉綠素（Chl）含量進(jìn)行了相關(guān)性分析（表8） 。由此表可以看出，用平均隸屬值評(píng)價(jià)蘋(píng)果砧木抗旱性最為科學(xué)。他與其他6個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到了顯著水平。決定系數(shù)均在0.5以上，說(shuō)明可以用平均隸屬值來(lái)代表其他6個(gè)指標(biāo)表示蘋(píng)果砧木抗旱性的大小。而其他6個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性則相對(duì)較差。相對(duì)電導(dǎo)率與葉綠素，POD之間呈極顯著正相關(guān)。可溶性蛋白與葉綠素之間呈極顯著正相關(guān)。電導(dǎo)率大小反映出蘋(píng)果葉片在干旱脅迫下細(xì)胞膜相對(duì)透性的變化，而葉綠素的變化則代表蘋(píng)果砧木葉片葉綠體受害程度的大小，二者之間極顯著正相關(guān)，說(shuō)明在干旱脅迫條件下，葉綠素含量越小，葉片細(xì)胞在干旱脅迫下的傷害就越大，蘋(píng)果砧木的抗旱性越差?？扇苄缘鞍缀康亩嗌俜从程O(píng)果砧木葉片滲透調(diào)節(jié)的能力，含量越多調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)，抗旱性也越強(qiáng)。并且認(rèn)為可溶性蛋白、葉綠素和電導(dǎo)率可作為鑒定組培苗抗旱的特定指標(biāo)。

3 討 論

干旱脅迫下，葉綠體結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致葉綠素含量下降[16]，試驗(yàn)研究表明，5種蘋(píng)果砧木葉綠素含量的變化隨脅迫濃度的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高基本上呈下降趨勢(shì)，新疆野蘋(píng)果表現(xiàn)為先下降后升高然后再下降，但總體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。蛋白質(zhì)因參與植物體內(nèi)各種代謝，對(duì)滲透調(diào)節(jié)有一定的貢獻(xiàn)作用[17]，它含量的多少直接反映植物的生長(zhǎng)狀況。本研究表明，隨著脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，各蘋(píng)果砧木葉片內(nèi)可溶性蛋白含量也達(dá)到了最大，說(shuō)明可溶性蛋白對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)是敏感的。

質(zhì)膜是植物抵御外界環(huán)境脅迫的第一道屏障，在環(huán)境脅迫下，植物細(xì)胞膜會(huì)受到不同程度的傷害。葉片相對(duì)電導(dǎo)率是反映葉片細(xì)胞膜受傷害的重要指標(biāo)。細(xì)胞電解質(zhì)外滲是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的必然結(jié)果?？剐栽降停~片質(zhì)膜的相對(duì)電導(dǎo)率增幅越大[18]。新疆野蘋(píng)果的增幅最小為7.865%，‘M9的增幅最大為14.431%。

植物的光合作用和呼吸作用因干旱脅迫受到抑制，體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化[19]和破壞膜結(jié)構(gòu)[20]，但由于體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的存在，因品種不同而表現(xiàn)的活性不同。本研究發(fā)現(xiàn)在PEG-6000脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸加大的情況下SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在20%PEG-6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理下達(dá)到了最大，POD活性表現(xiàn)為始終上升。這與李霞等[21]在對(duì)黃檗保護(hù)酶活性的研究一致。SOD在脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大時(shí)出現(xiàn)下降的情況，可能是由于細(xì)胞膜受到傷害，抗氧化酶活性被抑制的結(jié)果。這也表現(xiàn)出SOD比POD更容易受PEG-6000脅迫誘導(dǎo)。

在逆境脅迫下植物活性氧代謝失調(diào)，導(dǎo)致活性氧累積和膜脂過(guò)氧化損傷，造成丙二醛累積，脅迫越嚴(yán)重，MDA含量越大，則膜脂過(guò)氧化損傷越嚴(yán)重，抗旱性也越差[22]。

蘋(píng)果的抗旱機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的生理生化變化過(guò)程，受多種因素影響，單一依靠一種或少數(shù)幾個(gè)生理指標(biāo)作為抗旱性強(qiáng)弱鑒定的依據(jù)是不太可靠的，并且很難反映其抗旱本質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量得出的結(jié)論就有差別。因此本文采用隸屬函數(shù)法對(duì)供試材料進(jìn)行了抗旱性鑒定，這樣既消除了個(gè)別指標(biāo)的片面性又使得各品種或種抗旱性差異具有可比性，最終將這幾種蘋(píng)果砧木的抗旱性劃分為4類(lèi)：高抗：新疆野蘋(píng)果；中抗：平邑甜茶和八棱海棠；低抗：‘M26；不抗：‘M9。新疆野蘋(píng)果與平邑甜茶的研究結(jié)果與譚冬梅[23]研究結(jié)果一致，‘M26的抗旱性與閆芬芬[24]研究結(jié)果相似。并將平均隸屬函數(shù)值與6項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明隸屬函數(shù)值與6項(xiàng)指標(biāo)間均達(dá)到了顯著相關(guān)，決定系數(shù)均達(dá)到了0.5以上，因此可以用平均隸屬值來(lái)代替6項(xiàng)生理指標(biāo)所代表的抗旱性。

4 結(jié) 論

采用鑒定組培苗可溶性蛋白、葉綠素和電導(dǎo)率這三種特定生理指標(biāo)可預(yù)測(cè)后期苗子的抗旱性。最終得出這5種蘋(píng)果砧木的抗旱性為新疆野蘋(píng)果>平邑甜茶>八棱海棠>‘M26>‘M9。從研究材料和實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，喬化砧木的抗旱性要高于矮化砧木的抗旱性。

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