枇杷AS—PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

楊芩　付燕　王永清　陶煉　鄧群仙　范建新　鄧仁菊

摘 要： 【目的】建立和優(yōu)化枇杷AS-PCR反應(yīng)體系，為開(kāi)展枇杷S基因快速鑒定奠定基礎(chǔ)。【方法】以‘大五星、‘早鐘6號(hào)和‘龍泉5號(hào)為試材，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響枇杷AS-PCR反應(yīng)較大的Mg2+等5個(gè)因素的濃度進(jìn)行篩選，并對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)直觀分析法和DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行方差分析?！窘Y(jié)果】?jī)?yōu)化后的枇杷AS-PCR反應(yīng)分析體系為： 25 μL反應(yīng)體系中，含10×buffer2.5 μL，Mg2+濃度2.0 mmol·L-1，Taq酶1.5 U，引物0.5 μmol·L-1，模板DNA80ng，dNTPs0.4 mmol·L-1。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)；72℃延伸5 min，4 ℃保存。【結(jié)論】建立了基于S基因保守序列設(shè)計(jì)引物的枇杷AS-PCR反應(yīng)體系，利用該體系成功確定了‘大五星的S基因型為S2-S41，其中S41為新分離鑒定的枇杷S-RNase基因，它們?cè)贕enBank 上的登錄號(hào)分別為JQ228451 和JX217035。

關(guān)鍵詞： 枇杷； AS-PCR； 正交設(shè)計(jì)； 反應(yīng)體系

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪01-0062-07

配子體自交不親和性（GSI）在薔薇科果樹(shù)中普遍存在，是阻止自體受精，預(yù)防近親繁殖和保持遺傳變異的一種重要機(jī)制，這種特異的識(shí)別反應(yīng)在遺傳上受S位點(diǎn)復(fù)等位基因控制[1]。這主要表現(xiàn)為自花授粉或相同S基因型的品種異花授粉時(shí)，花粉管在花柱上部停止生長(zhǎng)，造成自花授粉或相同S基因型品種間授粉不結(jié)實(shí)[2]。長(zhǎng)期以來(lái)在實(shí)際生產(chǎn)中常依據(jù)品種間相互授粉的坐果率來(lái)選擇授粉樹(shù)，這種方法雖然直觀有效，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，同時(shí)由于不知道品種的S基因型，選擇時(shí)又具有較大的盲目性[3]。因此鑒定自交不親和的S基因型對(duì)生產(chǎn)栽培選擇授粉品種具有重要的指導(dǎo)意義。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基于S基因保守序列設(shè)計(jì)引物的S基因特異PCR分析成為一種快速、簡(jiǎn)便、可靠的S基因鑒定方法，并在蘋(píng)果、梨、甜櫻桃等果樹(shù)上得到了廣泛的應(yīng)用，但未見(jiàn)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系系統(tǒng)優(yōu)化的研究報(bào)道。為此我們建立并優(yōu)化了枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系，為今后開(kāi)展枇杷屬植物S基因鑒定，加強(qiáng)資源利用和指導(dǎo)生產(chǎn)選擇授粉品種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以栽植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝生物技術(shù)研究中心的‘大五星、‘早鐘6號(hào)和‘龍泉5號(hào)作為研究試材，采取未完全展開(kāi)的幼嫩葉片提取基因組DNA。

1.2 基因組DNA提取

按照楊芩等[4]的方法提取基因組DNA，提取物用60 μL去離子水溶解，核酸蛋白儀（Eppendorf，BioPhotometer plus）測(cè)定DNA的濃度和純度，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，-20 ℃保存。

1.3 引物來(lái)源

采用Ishimizu等[5]根據(jù)梨S-RNase 基因C1 區(qū)和C5 區(qū)下游保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物： 上游引物： ‘FTQQYQ： 5'-TTTACGCAGCAATATCAG-3'，和下游引物： ‘FI （D/N）CP（H/R）： 5'-GYGGGGGCARTYTATGAA-3'，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增和優(yōu)化設(shè)計(jì)

采用L25（56）正交表，參照甜櫻桃[6]和蘋(píng)果[7]的AS-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系對(duì)影響反應(yīng)較大的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模板DNA濃度進(jìn)行五因素五水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平見(jiàn)表1，以空白項(xiàng)為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析。

按表2編號(hào)加樣，除表中所列因素外，還包括2.5 μL10×buffer，加去離子水補(bǔ)足25 μL。以‘大五星DNA為模板對(duì)以上各因素進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)程序在參照甜櫻桃[6]、蘋(píng)果[7]AS-PCR反應(yīng)程序的基礎(chǔ)上，初步確定為94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的反應(yīng)體系，對(duì)引物的最佳退火溫度進(jìn)行篩選。根據(jù)引物Tm值，設(shè)定退火溫度（48～62 ℃），PCR儀（Bio-Rad公司PTC-200）自動(dòng)生成12個(gè)溫度梯度： 48 ℃、48.4 ℃、49.2℃、50.3 ℃、51.9 ℃、54 ℃、56.3 ℃、58.3 ℃、59.9 ℃、60.9 ℃、61.7 ℃、62.0 ℃。同時(shí)對(duì)循環(huán)次數(shù)、退火時(shí)間、延伸時(shí)間等影響AS-PCR反應(yīng)的重要因素進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 電泳結(jié)果評(píng)分及差異分析

參照何正文等[8]、付燕等[9]的正交設(shè)計(jì)直觀分析方法，對(duì)3次重復(fù)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果分別評(píng)分。依擴(kuò)增譜帶特異性與敏感性即譜帶多少、亮度的強(qiáng)弱和有無(wú)彌散現(xiàn)象評(píng)分，特異性譜帶越多、亮度越強(qiáng)、無(wú)彌散現(xiàn)象評(píng)分越高，反之評(píng)分越低。最好的處理定為25分，最差的處理定為1分，以這2個(gè)處理的結(jié)果為比較標(biāo)準(zhǔn)，再將其他處理的譜帶結(jié)果與這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)比較依次評(píng)分，評(píng)分結(jié)果用SNK法隨機(jī)區(qū)組模型（DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件）進(jìn)行方差分析。

1.6 S-RNase 基因克隆與序列分析

擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色，Syngene 凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司），對(duì)PCR產(chǎn)物目的片段進(jìn)行回收并連接到PGEM-Teasy （上海潤(rùn)成生物科技有限公司） 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR鑒定，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序（北京華大中生科技發(fā)展有限公司）。獲得序列分別利用國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的Blast和Nucleotide 軟件進(jìn)行同源性序列檢索與序列登記。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析評(píng)分及差異分析

按表2的5因素5水平正交設(shè)計(jì)25個(gè)處理進(jìn)行PCR反應(yīng)后，將得到的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，其中1次重復(fù)電泳圖譜如圖1所示。不同Taq酶用量、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度和模板用量擴(kuò)增的結(jié)果各不相同。各處理的直觀分析評(píng)分結(jié)果如表3所示。

采用DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件運(yùn)用SNK法隨機(jī)區(qū)組模型對(duì)各處理直觀分析評(píng)分進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。由F值可知，Mg2+對(duì)反應(yīng)影響最大，Taq酶影響最小，各因素水平變化對(duì)PCR反應(yīng)影響大小依次為： Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq酶。由于各因素水平間對(duì)AS-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響差異顯著，進(jìn)一步在因素內(nèi)進(jìn)行多重比較。

2.2. 各因素對(duì)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響

2.2.1 Mg2+濃度對(duì)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響 從表4中可以看出，PCR擴(kuò)增結(jié)果受Mg2+濃度影響最大。從圖2可以看出，隨著Mg2+濃度增加，直觀評(píng)分結(jié)果均值總體呈先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)Mg2+濃度增加到2.0 mmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果均值最大，當(dāng)Mg2+濃度增加到2.5 mmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果均值迅速下降。Mg2+各濃度間多重比較結(jié)果表明，25 μL體系中，各濃度間直觀評(píng)分結(jié)果差異極顯著。反應(yīng)液中的Mg2+濃度直接影響Taq酶活性，過(guò)低的Mg2+濃度使得Taq酶活性不能有效發(fā)揮，進(jìn)而影響引物與模板的結(jié)合；而過(guò)高的Mg2+濃度又使得Mg2+與底物競(jìng)爭(zhēng)Taq酶，抑制了酶的活性。因此，確定合適的Mg2+濃度對(duì)AS-PCR反應(yīng)至關(guān)重要。根據(jù)電泳圖譜與評(píng)分結(jié)果分析可知，適宜的Mg2+濃度為2.0 mmol·L-1。

2.2.2 Taq酶濃度對(duì)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響 從方差分析可知Taq酶對(duì)AS-PCR反應(yīng)影響最?。ū?），這與圖3中Taq酶用量間的直觀評(píng)分結(jié)果變化幅度一致。Taq酶因素內(nèi)各水平多重比較結(jié)果表明，Taq酶用量為1.5 U時(shí)擴(kuò)增結(jié)果顯著好于其他各用量，其他用量間差異不顯著，綜上認(rèn)為在25 μL 反應(yīng)體系中1.5U Taq酶用量為枇杷AS-PCR反應(yīng)的適宜參數(shù)。

2.2.3 引物濃度對(duì)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響 引物濃度對(duì)枇杷AS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有較大的影響（表4），引物多少關(guān)系到擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)與量，濃度太低不能進(jìn)行有效的擴(kuò)增，濃度太高會(huì)增加錯(cuò)配，增加非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的形成，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不是所需的特異性產(chǎn)物，或條帶不穩(wěn)定及清晰度下降。隨著引物濃度增加，擴(kuò)增結(jié)果直觀評(píng)分均值逐漸增加，當(dāng)引物濃度為0.5 μmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果均值最大，當(dāng)引物濃度增加為0.6 μmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果均值迅速下降。引物因素內(nèi)各濃度間多重比較結(jié)果表明，濃度為0.5 μmol·L-1時(shí)擴(kuò)增效果顯著好于其他濃度，因此選擇引物濃度為0.5 μmol·L-1為本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)參數(shù)。

2.2.4 模板濃度對(duì)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響 由方差分析可見(jiàn)，模板對(duì)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)影響較小，在40～80 ng內(nèi)擴(kuò)增效果均較好（圖5）。DNA因素內(nèi)各用量多重比較結(jié)果表明，當(dāng)模板DNA用量為80 ng或120 ng時(shí)擴(kuò)增效果較好，并顯著好于其他用量處理，因此確定80 ng模板用量為本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)參數(shù)。

2.2.5 dNTPs對(duì)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響 由方差分析可見(jiàn)，dNTPs的用量對(duì)枇杷AS-PCR反應(yīng)影響僅次于Mg2+。直觀評(píng)分結(jié)果均值顯示，在dNTPs濃度為0.40 mmol·L-1時(shí)就有較好的擴(kuò)增結(jié)果，因素內(nèi)各濃度多重比較結(jié)果表明（圖6），dNTPs濃度為0.40 mmol·L-1時(shí)擴(kuò)增結(jié)果顯著好于0.60 mmol·L-1、0.80 mmol·L-1、1.00 mmol·L-1 3個(gè)濃度處理，雖然當(dāng)濃度增加至1.20 mmol·L-1時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果最好且顯著好于其他濃度處理，綜合考慮擴(kuò)增效果和節(jié)約成本，選擇dNTPs濃度0.40 mmol·L-1為本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)參數(shù)。

2.3 退火溫度對(duì)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響

AS-PCR引物序列一般由18～30個(gè)堿基組成，并且不同特異引物的GC含量差異較大，造成不同引物最佳退火溫度差異較大。圖7所示為退火溫度對(duì)本實(shí)驗(yàn)所用引物組合的影響電泳圖譜。一般而言，退火溫度偏低，背景模糊，同時(shí)非特異帶擴(kuò)增增加，給試驗(yàn)結(jié)果分析帶來(lái)極大的困擾；退火溫度逐漸升高，可以減少不匹配的雜交，從而非特異性帶擴(kuò)增逐漸減少，背景也逐漸清晰，擴(kuò)增出的特異性帶整齊明亮，但如果退火溫度過(guò)高，擴(kuò)增條帶少會(huì)使某一特異性條帶無(wú)法擴(kuò)增，這也會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析造成較大的困擾，因此篩選不同引物組合的最適退火溫度對(duì)枇杷AS-PCR反應(yīng)至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)所用引物組合（圖7），當(dāng)退火溫度低于54 ℃時(shí)，擴(kuò)增條帶明顯增多，許多大分子質(zhì)量片段得到擴(kuò)增，但背景較模糊，進(jìn)一步的試驗(yàn)分析與處理；當(dāng)退火溫度高于54 ℃時(shí)，特異性條帶逐漸減少，最后不能擴(kuò)增出特異性條帶。因此，綜合考慮擴(kuò)增的完整性和清晰度，本實(shí)驗(yàn)引物組合最佳退火溫度確定為54 ℃。

2.4 退火時(shí)間對(duì)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了25 s、30 s、40 s、50 s 4個(gè)退火時(shí)間對(duì)最佳退火時(shí)間進(jìn)行篩選，結(jié)果表明退火時(shí)間為25 s時(shí)，擴(kuò)增條帶有缺失，特異性帶擴(kuò)增量較少且有彌散現(xiàn)象；適當(dāng)延長(zhǎng)退火時(shí)間，擴(kuò)增條帶逐漸增加，特異性帶擴(kuò)增效率增高，彌散現(xiàn)象逐漸消失；但如果退火時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)可能增加錯(cuò)誤匹配的可能性和引發(fā)錯(cuò)誤雜交，會(huì)增加非特異性帶的擴(kuò)增，降低特異性帶的擴(kuò)增效率，特異性條帶變?nèi)?。退火時(shí)間為30 s時(shí)，擴(kuò)增條帶完整清晰（圖8），因此，本實(shí)驗(yàn)退火時(shí)間為30 s。

2.5 循環(huán)次數(shù)對(duì)枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響

循環(huán)次數(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的量具有重要影響，且不同植物、不同PCR適合的循環(huán)次數(shù)不同。循環(huán)次數(shù)不夠，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物少，部分特異性譜帶不能得到有效擴(kuò)增；過(guò)多的循環(huán)次數(shù)可導(dǎo)致發(fā)生錯(cuò)配的比例上升，容易擴(kuò)增非特異性的產(chǎn)物，引起彌散現(xiàn)象，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分析造成干擾。本實(shí)驗(yàn)研究了30、35、40次循環(huán)對(duì)枇杷AS-PCR反應(yīng)的影響，電泳圖譜如圖9所示，30次循環(huán)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物不足，條帶弱且有缺失；35次循環(huán)擴(kuò)增譜帶亮度高，清晰度好；而40次循環(huán)時(shí)出現(xiàn)了一些非特異性譜帶，同時(shí)有彌散現(xiàn)象，條帶不清。因此確定35次循環(huán)為本實(shí)驗(yàn)的最適反應(yīng)循環(huán)參數(shù)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析，優(yōu)化枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系，在25 μL反應(yīng)體系中，含10×buffer2.5 μL，Mg2+2.0 mmol·L-1，Taq酶1.5U，引物0.5 μmol·L-1，模板80 ng，dNTPs0.4 mmol·L-1。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。

2.6 ‘大五星枇杷S基因型確定及新S-RNase基因的鑒定

采取上述優(yōu)化體系，用上述兼并引物對(duì)‘大五星、‘早鐘6號(hào)和‘龍泉5號(hào)3個(gè)品種進(jìn)行AS-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖10所示，擴(kuò)增譜帶清晰，能有效擴(kuò)增S等位基因特異性譜帶。在‘大五星中擴(kuò)增出的600～700 bp譜帶進(jìn)行回收與克隆，測(cè)序后獲得654 bp的序列，Blast同源序列檢索表明，該序列與已登記的枇杷屬植物S2等位基因（GenBank： GU384665.1）同源性為99%，在GenBank上的登錄號(hào)為JQ228451。

此外，核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，‘大五星中擴(kuò)增出的768 bp譜的序列（暫命名為SX）與GenBank中枇杷S1-RNase基因（GenBank： EU442285.1）的核苷酸序列同源性為96%。由推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)分析（圖 11）可知，Sx與S1-RNase共有10處氨基酸替換及4處氨基酸插入，其中2處氨基酸替換及所有氨基酸插入位置為鑒定S基因的HV區(qū)，因此可以確定Sx為枇杷的新S基因，命名為S41-RNase（GenBank： JX217035），并確定‘大五星的S基因型為S2-S41。

3 討 論

AS-PCR方法在鑒定薔薇科植物的S-RNase 基因中得到廣泛的應(yīng)用[3]。雖然與RADP、ISSR與S-SAP等PCR反應(yīng)一樣，AS-PCR反應(yīng)受體系各成分濃度、引物退火溫度與時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等反應(yīng)程序因素的影響[6]，但AS-PCR是根據(jù)等位基因多態(tài)性設(shè)計(jì)一系列等位基因特異引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增[10]，其擴(kuò)增譜帶較少且具有特異性，對(duì)影響反應(yīng)的因素變化更為敏感。本實(shí)驗(yàn)中Mg2+濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響最大，其次是dNTPs濃度，雖然dNTPs是PCR反應(yīng)的原料，但從篩選出的最適濃度來(lái)看，dNTPs的濃度較低為設(shè)置的最小水平0.4 mmol·L-1，其濃度升高可能降低了反應(yīng)液中自由Mg2+的濃度而影響了酶的活性，從而影響了擴(kuò)增結(jié)果[11]。

S基因特異PCR一般分別以多個(gè)等位基因的保守區(qū)和某一S基因的多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)兼并引物和特異引物，引物間GC含量差異較大，且引物序列長(zhǎng)度不一。因此對(duì)引物的最適退火溫度進(jìn)行篩選十分重要，本研究采用溫度梯度PCR方法尋找所用引物組合的最適退火溫度，表明在一定的溫度范圍內(nèi)，退火溫度低擴(kuò)增的條帶多，非特異帶較多，不利于特異條帶的回收，溫度升高非特異擴(kuò)增減少，特異帶擴(kuò)增增強(qiáng)，這與付燕等[9]和胡甦等[11]在ISSR反應(yīng)體系中的研究結(jié)果一致。

本研究采用正交設(shè)計(jì)對(duì)影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素水平進(jìn)行綜合篩選，運(yùn)用得到的優(yōu)化體系對(duì)‘早鐘6號(hào)、‘大五星和‘龍泉5號(hào) 3個(gè)品種進(jìn)行了S等位基因進(jìn)行了擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增譜帶清晰且穩(wěn)定，重復(fù)性好，擴(kuò)增出的S等位基因特異條帶整齊性較好，有利于進(jìn)一步開(kāi)展回收及克隆工作。本研究基于梨S等位基因保守序列設(shè)計(jì)引物建立的枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系填補(bǔ)了枇杷屬植物S等位基因特異PCR快速鑒定的技術(shù)空白，為枇杷屬植物種、品種S基因的快速鑒定及序列分析奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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