五葉草莓超低溫保存及遺傳穩(wěn)定性分析

朱文濤　周厚成　王子成

摘 要：【目的】為了找出野生種質(zhì)資源五葉草莓（Fragaria pentapylla）的超低溫保存方法和分析超低溫保存后五葉草莓的遺傳信息穩(wěn)定性，【方法】運(yùn)用玻璃化法對(duì)五葉草莓離體莖尖超低溫保存技術(shù)進(jìn)行了研究，并采用AFLP和MSAP技術(shù)對(duì)其遺傳穩(wěn)定性作了探討。【結(jié)果】結(jié)果表明，不同的低溫鍛煉時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、預(yù)處理時(shí)間、玻璃化溶液（PVS2）處理時(shí)間和液氮保存時(shí)間對(duì)五葉草莓超低溫保存后成活率的影響各不相同，經(jīng)優(yōu)化后，低溫鍛煉3周，預(yù)培養(yǎng)3 d，預(yù)處理30 min，PVS2處理60 min時(shí)，超低溫保存的最高成活率可達(dá)79.7%，液氮處理時(shí)間對(duì)成活率影響不明顯；運(yùn)用AFLP技術(shù)對(duì)超低溫后成活生長(zhǎng)120 d的材料及對(duì)照材料基因組DNA進(jìn)行了分析，超低溫前后帶型一致，未發(fā)現(xiàn)明顯差異片段；進(jìn)一步用MSAP技術(shù)分析了超低溫保存后成活的材料和對(duì)照材料DNA甲基化水平差異，結(jié)果表明超低溫保存后五葉草莓DNA甲基化與去甲基化分別為5.70%和12.43%?！窘Y(jié)論】玻璃化法超低溫保存技術(shù)可以有效的保存五葉草莓種質(zhì)資源，超低保存前后的五葉草莓基因組DNA沒(méi)有發(fā)生多態(tài)性變化，但DNA甲基化水平降低。

關(guān)鍵詞： 五葉草莓； 超低溫保存； 玻璃化法； 遺傳穩(wěn)定性； 甲基化

中圖分類(lèi)號(hào)：S668.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪01-0055-07

栽培種鳳梨草莓（Fragaria ananassa Duch.）是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的園藝作物，目前被視為一種經(jīng)濟(jì)植物而被廣泛栽培[1]。由于野生草莓具有廣泛的適應(yīng)性和多種優(yōu)良特性，例如：風(fēng)味品質(zhì)、抗病、抗蟲(chóng)和抗不良環(huán)境脅迫等，通常作為栽培種草莓改良的重要材料[1-3]。五葉草莓（Fragaria pentapylla），也叫泡兒，秧泡兒，原產(chǎn)我國(guó)，是我國(guó)豐富的野生草莓資源的一種[4]，它具有抗寒、抗病性強(qiáng)、果實(shí)香味濃等特點(diǎn)，是進(jìn)行栽培種培育和改良的理想親本。同時(shí)，五葉草莓屬于二倍體草莓，染色體數(shù)目少[5]，基因組小得多，使其成為薔薇科植物基因功能研究中有應(yīng)用潛力的良好材料。五葉草莓以及野生草莓都是寶貴的野生資源，然而目前沒(méi)有一種有效的手段使其種質(zhì)資源得到長(zhǎng)期保存。

上世紀(jì)70—80年代建立起的超低溫保存技術(shù)對(duì)種質(zhì)資源保存具有重要的意義[6-7]。超低溫保存技術(shù)是將植物材料保存在-80 ℃及其以下，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝與生長(zhǎng)活動(dòng)近乎停止，處于“生機(jī)停頓”（suspended animation）狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)植物材料的長(zhǎng)期保存。目前，進(jìn)行超低溫保存的方法有多種[6-7]，主要是玻璃化法、包埋干燥法、包埋玻璃化法、小滴玻璃化法等。然而，植物在超低溫保存過(guò)程中，會(huì)涉及到一系列的脅迫[8]，這些脅迫有可能對(duì)其遺傳的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響。近年來(lái)，許多學(xué)者就超低溫保存后再生材料的遺傳穩(wěn)定性問(wèn)題做了大量的研究和分析，主要集中在：（1）超低溫保存材料的基因組遺傳穩(wěn)定性研究；（2）超低溫保存再生材料的表觀遺傳信息變異情況分析等方面[8]。在基因組穩(wěn)定性方面，許多學(xué)者運(yùn)用了AFLP[9]、RAPD等多種技術(shù)對(duì)材料的基因組進(jìn)行了分析，袋鼠花（Anigozanthos viridis）[10]、蘋(píng)果[11]、擬南芥[12]、椰子（Cocos nucifera L.）[13]等大部分研究都證明了超低溫之后基因組沒(méi)有發(fā)生改變，但是在冷杉[14]、木瓜[14-15]等少數(shù)研究中卻發(fā)現(xiàn)其基因組改變的現(xiàn)象。對(duì)超低溫保存中的DNA甲基化變化的研究中，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果[10]、木瓜[15]、蛇麻草（Humulus lupulus）[16]、擬南芥[17]、虎耳草科酷栗屬[18]等不同基因型的植物材料經(jīng)過(guò)超低溫保存后甲基化水平均發(fā)生了不同程度的變化。我們采用玻璃化法對(duì)五葉草莓進(jìn)行了超低溫保存，運(yùn)用AFLP技術(shù)對(duì)超低溫保存前后五葉草莓材料的基因組信息進(jìn)行分析，以確定五葉草莓材料超低溫保存后基因組遺傳穩(wěn)定性是否良好，同時(shí)運(yùn)用MSAP技術(shù)對(duì)超低溫前后的五葉草莓的DNA甲基化水平進(jìn)行分析，探討五葉草莓超低溫前后的甲基化水平變化以及變化趨勢(shì)，以期為完善超低溫保存后五葉草莓的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以河南大學(xué)植物種質(zhì)資源及遺傳實(shí)驗(yàn)室提供的五葉草莓 （F. pentapylla） 幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，五葉草莓采自秦嶺地區(qū)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織培養(yǎng)體系的建立 自田間選取五葉草莓健壯的匍匐莖，取1.5～3.0 cm長(zhǎng)的頂芽，采用常規(guī)方法進(jìn)行清洗和消毒，選用MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L-1作為五葉草莓誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS+6-BA 0.5 mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L-1作為繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)出大量的五葉草莓組培苗。

1.2.2 超低溫保存過(guò)程 采用的超低溫方法為玻璃化法[17，19]，該方法在前人的基礎(chǔ)上加以改良，其具體的操作流程為：首先，將繼代培養(yǎng)25 d的試管苗置于4 ℃冰箱低溫鍛煉，并設(shè)置時(shí)間梯度為0、1、2、3、4、5周，記錄植株生長(zhǎng)情況；其次，取低溫鍛煉后的試管苗，在無(wú)菌條件下切取莖尖約5 mm，將其置于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS +0.4 mol·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，pH=5.8）中4 ℃預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為0、1、2、3、4 d；然后，將莖尖轉(zhuǎn)入加有液體預(yù)處理培養(yǎng)基的無(wú)菌冷凍管中20 ℃預(yù)處理，每管15個(gè)莖尖，預(yù)處理時(shí)間0、10、20、30、40 min；然后用無(wú)菌膠頭滴管吸出預(yù)處理液，加入玻璃化溶液PVS2（MS+30%（w/v）甘油+15%（w/v）乙二醇+15%（w/v）DMSO+0.4 mol·L-1）0 ℃處理0、20、40、60、100 min；接下來(lái)，將冷凍管放入紗布袋并迅速投入液氮中保存1、7、14 d；最后，將材料快速取出，42 ℃水浴化凍處理2～3 min，在超凈工作臺(tái)下吸去冷凍保護(hù)液，用含有1.0 mol·L-1蔗糖的MS洗滌液將莖尖洗滌3次，每次10 min，并接種到恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)（培養(yǎng)條件：溫度 （24±1）℃，光照12 h·d-1），21～25 d統(tǒng)計(jì)數(shù)量并計(jì)算成活率。

試驗(yàn)重復(fù)3次，求平均成活率。計(jì)算公式為：

成活率（%）=（玻璃化超低溫保存后成活的莖尖數(shù)/保存的總莖尖數(shù)）×100

1.2.3 五葉草莓超低溫保存前后AFLP分析 采用改良的CTAB法[20]提取五葉草莓總DNA， -20 ℃保存?zhèn)溆谩FLP分子標(biāo)記技術(shù)的實(shí)驗(yàn)程序主要參照Turner等[10]和郝玉金等[11]的AFLP程序，引物設(shè)計(jì)如表1。AFLP分子標(biāo)記技術(shù)主要包括以下幾個(gè)過(guò)程：選用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI/MseI對(duì)目的基因組DNA進(jìn)行雙酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測(cè)。

1.2.4 超低溫前后五葉草莓DNA甲基化變化MSAP分析 利用MSAP技術(shù)分析基因組的DNA甲基化變化，此方法主要參照Cervera等[21]與何艷霞等[17]的方法，引物設(shè)計(jì)如表1。該方法在AFLP的基礎(chǔ)上用對(duì)甲基化敏感的MspⅠ和HapⅡ代替AFLP分子標(biāo)記中的高頻酶MseⅠ，然后用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ的組合對(duì)目的DNA進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物隨后進(jìn)行連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增、電泳及銀染，其操作過(guò)程和程序與上述AFLP分析的操作一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 超低溫保存結(jié)果與分析

2.1.1 低溫鍛煉對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響

對(duì)五葉草莓低溫鍛煉時(shí)間不同，其超低溫保存后成活率也會(huì)受到不同程度的影響，低溫鍛煉能明顯影響保存后莖尖存活率。如圖1所示鍛煉21 d時(shí)存活率為最高值51.9%，隨著鍛煉時(shí)間的延長(zhǎng)，成活率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。在低溫鍛煉期間觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)28 d后試管苗葉片逐漸變成黃褐色，保存后再生材料存活率也有所下降。

2.1.2 固體預(yù)培養(yǎng)對(duì)超低溫保存成活率的影響 用固體預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)五葉草處理的時(shí)間不同，則超低溫保存后成活率的影響也不同。固體預(yù)培養(yǎng)能明顯影響保存后莖尖存活率，如圖2所示固體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)存活率為61.5%。低溫鍛煉3周的苗在只改變固體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的條件下，其他條件限定在液體處理時(shí)間20 min，pvs2處理時(shí)間60 min，超低溫處理時(shí)間1 d，固體預(yù)培養(yǎng)為3 d。

2.1.3 液體處理培養(yǎng)基對(duì)超低溫保存成活率的影響

對(duì)五葉草莓液體進(jìn)行不同時(shí)間的處理，則其超低溫保存后成活率影響也不同，液體處理時(shí)間能明顯影響保存后莖尖存活率。液體預(yù)處理隨著時(shí)間的增加，成活率表現(xiàn)為先增加后減小的趨勢(shì)，在處理30 min時(shí)成活率最高，達(dá)到79.7%（圖3）。

2.1.4 PVS2處理對(duì)超低溫保存成活率的影響 超低溫玻璃化過(guò)程是對(duì)保存起著至關(guān)重要的作用，冰凍保護(hù)劑PVS2處理使莖尖內(nèi)組織進(jìn)一步脫水則是玻璃化過(guò)程中極為關(guān)鍵的一步。結(jié)果表明（圖4）PVS2處理60 min時(shí)的莖尖成活率為79.7%，達(dá)到最高，時(shí)間過(guò)短或更長(zhǎng)都不利于莖尖的成活和再生。這很可能是由于時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致的玻璃化不完全，從而在凍存過(guò)程中植物莖尖受到損傷。當(dāng)處理時(shí)間高于60 min時(shí)，由于PVS2本身對(duì)材料有毒害作用，進(jìn)而導(dǎo)致莖尖存活率下降。

2.2 超低溫前后的AFLP分析結(jié)果

應(yīng)用AFLP技術(shù)對(duì)超低溫保存前后的五葉草莓材料進(jìn)行檢測(cè)分析，14對(duì)引物共擴(kuò)增出可統(tǒng)計(jì)條帶526條，部分條帶如圖5所示，在超低溫保存前后的五葉草莓材料之間沒(méi)有出現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)。說(shuō)明對(duì)照與超低溫處理樣品之間基因組序列保持一致，沒(méi)有發(fā)生該方法可以檢測(cè)到的遺傳變異。

2.3 超低溫前后的MSAP分析

HpaⅡ和MspⅠ是一組均識(shí)別并切割5CCGG 3 序列的同裂酶，HpaⅡ?qū)Π奏さ募谆瘶O其敏感，它不能切割任何一個(gè)或兩個(gè)均甲基化的序列，能夠識(shí)別切割單鏈發(fā)生甲基化。MspⅠ對(duì)內(nèi)部胞嘧啶的甲基化是不敏感的，對(duì)外部胞嘧啶的甲基化則很敏感。因此，超低溫處理和對(duì)照五葉草莓材料提取的DNA經(jīng)HpaⅡ/EcoRⅠ（H）和MspⅠ/EcoRⅠ（M）酶切后的產(chǎn)物通常有4種甲基化類(lèi)型，但是，在聚丙烯酰胺凝膠電泳分析膠上只能檢測(cè)出3種甲基化類(lèi)型（圖6）。其中，類(lèi)型Ⅰ表明CCGG位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生甲基化變化，類(lèi)型Ⅱ表明CCGG位點(diǎn)發(fā)生了半甲基化，類(lèi)型III表明CCGG位點(diǎn)發(fā)生了全甲基化。為了檢測(cè)五葉草莓經(jīng)過(guò)超低溫處理后DNA甲基化的模式，利用不同的引物組合（表1）對(duì)超低溫處理樣品及對(duì)照組的基因組DNA進(jìn)行MSAP分析。由表2可知，經(jīng)超低溫處理后五葉草莓全基因組DNA胞嘧啶甲基化水平降低，且全甲基化率高于半甲基化率。

本實(shí)驗(yàn)一共利用12種不同引物組合對(duì)五葉草莓超低溫保存前后的DNA雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果共出現(xiàn)12種帶型（表3），這些帶型又分為多態(tài)性和單態(tài)性2種。多態(tài)性又有3種狀態(tài)即甲基化（A型）、去甲基化（B型）以及不定類(lèi)型（C型），表明CCGG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)在超低溫處理之后發(fā)生不同的改變。A型中的A1和A2為重新甲基化（對(duì)照H和M泳道均有條帶，而處理僅H或M泳道有條帶），A3和A4為超甲基化（對(duì)照僅H或M有一條帶，而處理H和M泳道均無(wú)帶）。A型表明超低溫處理誘導(dǎo)五葉草莓基因組DNA發(fā)生了甲基化水平增加的變化；B型含B1、B2、B3和B4，為去甲基化類(lèi)型，甲基化狀態(tài)與A型相反，表明超低溫處理后基因組DNA發(fā)生了甲基化水平下降的變化；C型為不定類(lèi)型，對(duì)照組與處理組中DNA甲基化程度的差異無(wú)法確定。單態(tài)性即對(duì)照與處理之間有相同的帶型 （D型），表明低溫處理后CCGG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)沒(méi)發(fā)生變化。其中，D1型為未甲基化，D2和D3為半甲基化。處理與對(duì)照的甲基化模式帶型A、B、C和D及相應(yīng)的位點(diǎn)數(shù)見(jiàn)表3。

由表4可知，超低溫處理的五葉草莓基因組DNA甲基化（A型）位點(diǎn)數(shù)為11，占總甲基化多態(tài)性擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)的5.70%；去甲基化（B型）位點(diǎn)數(shù)為24，占總甲基化多態(tài)性擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)的12.43%。與對(duì)照相比，超低溫處理后的總甲基化多態(tài)性為19.17%，甲基化狀態(tài)未發(fā)生變化（D型）的比率為80.83%。

由此推測(cè)，經(jīng)超低溫處理后五葉草莓基因組DNA的甲基化與對(duì)照相比發(fā)生了變化，總甲基化比率降低；在擴(kuò)增的甲基化位點(diǎn)中，去甲基化的位點(diǎn)數(shù)高于發(fā)生甲基化的位點(diǎn)數(shù)，同時(shí)基因組DNA甲基化多態(tài)性也隨之增加。

3 討 論

研究首次利用玻璃化法對(duì)五葉草莓材料進(jìn)行了超低溫保存試驗(yàn)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：低溫鍛煉3周，能明顯提高五葉草莓莖尖超低溫保存的存活率；固體預(yù)培養(yǎng)基中加入甘油對(duì)五葉草莓的成活率影響非常大，去除甘油后五葉草莓的成活率明顯提高，固體預(yù)培養(yǎng)3 d，能明顯提高成活率；液體預(yù)處理時(shí)間為30 min時(shí)，對(duì)五葉草莓的超低溫保存最為有利； PVS2處理是超低溫保存過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，缺少或處理時(shí)間不當(dāng)對(duì)保存后莖尖成活率存在顯著影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PVS2處理時(shí)間并不是越長(zhǎng)越好，當(dāng)處理時(shí)間為60 min時(shí)存活率達(dá)到最高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，液氮凍存時(shí)間對(duì)超低溫保存五葉草莓的存活率并無(wú)顯著影響，成活率并未產(chǎn)生太大變化，郝玉金等[11]、李俊慧等[19]的研究相符，說(shuō)明超低溫保存技術(shù)可以作為五葉草莓種質(zhì)資源保存的可靠技術(shù)。

AFLP技術(shù)是檢測(cè)DNA多態(tài)性常用的技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)采用14對(duì)引物共擴(kuò)增出可統(tǒng)計(jì)條帶526條帶，沒(méi)有出現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)，說(shuō)明對(duì)照與超低溫處理樣品之間基因組序列保持一致，這與Turner等[10]、郝玉金等[11]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明玻璃化法超低溫保存技術(shù)可以作為五葉草莓種質(zhì)資源保存的有效手段。

MSAP技術(shù)是分析基因組甲基化多態(tài)性的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，超低溫處理對(duì)五葉草莓的甲基化有一定程度的影響，與對(duì)照相比，甲基化水平發(fā)生了變化，DNA甲基化位點(diǎn)數(shù)占總甲基化多態(tài)性擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)的5.70%；去甲基化位點(diǎn)數(shù)占總甲基化多態(tài)性擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)的12.43%。結(jié)果表明玻璃化法超低溫保存成活的五葉草莓甲基化水平降低了6.73%，這與木瓜[15]、蛇麻草（Humuluslupulus）[16]、擬南芥[17]等植物超低溫保存后的甲基化變化趨勢(shì)相類(lèi)似。這種變化趨勢(shì)可能是植物對(duì)超低溫保存這種逆境處理的一種遺傳適應(yīng)，其內(nèi)在機(jī)制目前未明，需要進(jìn)一步的深入探討。

4 結(jié) 論

玻璃化法超低溫技術(shù)作為一種有效的植物種質(zhì)資源超低溫保存方法，可以用于五葉草莓種質(zhì)資源的保存，這樣不僅使其保存后的成活率達(dá)到了一個(gè)比較高的水平，且超低保存前后五葉草莓基因組DNA多態(tài)性并無(wú)發(fā)生變化。但是研究表明超低保存前后的五葉草莓基因組DNA甲基化水平發(fā)生了一定的變化，因此我們需要深入研究甲基化水平的變化對(duì)五葉草莓在生理生化方面帶來(lái)的影響。

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