‘琯溪蜜柚’熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

王梨嬛　潘永娟　楊莉　蔡盛華　黃新忠

摘 要：【目的】為了克隆‘琯溪蜜柚的管家基因，并篩選合適的管家基因作為內(nèi)參，【方法】以‘琯溪蜜柚盛花期后5個(gè)不同時(shí)期的果實(shí)汁胞，以及根﹑莖﹑葉為材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 5 個(gè)管家基因在不同材料中的表達(dá)情況，并結(jié)合 geNorm、NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 種評(píng)估方法進(jìn)行穩(wěn)定性分析?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明， actin1和β-tubulin是‘琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而 EF1-α和β-tubulin 則是研究不同組織特定靶基因表達(dá)中穩(wěn)定的內(nèi)參基因?！窘Y(jié)論】篩選出了‘琯溪蜜柚最佳的內(nèi)參基因β-tubulin，為今后目的基因的表達(dá)分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： ‘琯溪蜜柚； 熒光定量PCR； 內(nèi)參基因

中圖分類號(hào)：S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪01-0048-07

實(shí)時(shí)熒光定量 RT- PCR（ real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR， qRT- PCR ）是在傳統(tǒng) PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種新型、高效的核酸定量技術(shù)，實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng) PCR 從定性到定量的飛躍，具有實(shí)時(shí)性、速度快、高通量及自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子診斷、生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的基因表達(dá)、DNA/RNA 拷貝數(shù)檢測(cè)，以及單核苷酸多態(tài)性等方面的研究[1-4]。

基因表達(dá)分析已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)眾多研究領(lǐng)域，對(duì)發(fā)現(xiàn)和預(yù)測(cè)新基因及其功能、了解基因調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等有重要作用。在基因表達(dá)研究中，要精確判斷特定靶基因表達(dá)的水平，需要有一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)⑽粗獦颖究偤怂崃繕?biāo)準(zhǔn)化[5]。目前一般選擇管家基因作為內(nèi)參，但很多管家基因隨環(huán)境、物種、組織來源及試驗(yàn)條件等改變，其表達(dá)水平也有所變化[6]。因此，針對(duì)特定試驗(yàn)條件和樣品選擇合適的內(nèi)參基因?qū)Π谢蜻M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，是獲得準(zhǔn)確基因表達(dá)結(jié)果的重要前提[7-8]。

‘琯溪蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck ‘Guanxi Sweet Pummelo]屬亞熱帶常綠喬木果樹，是我國(guó)特有的柚類良種，以其皮薄、肉嫩、汁多、酸甜適口等優(yōu)良品質(zhì)而享譽(yù)海內(nèi)外，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，運(yùn)用生理和分子生物學(xué)手段研究柑橘類各種次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控及其機(jī)制已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[9-17]。本研究應(yīng)用 qRT- PCR 技術(shù)及 4 種可行性方法評(píng)估 5 個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選‘琯溪蜜柚不同果實(shí)發(fā)育時(shí)期及不同組織最適的內(nèi)參基因。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)以 2008 年和 2009 年的‘琯溪蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck ‘Guanxi Sweet Pummelo]盛花期后（ days after flowering， DAF ）45、75、105、135、165 d 的果實(shí)汁胞，以及根﹑莖﹑葉組織為材料，每份材料重復(fù) 3 次取樣。所用材料由福建省農(nóng)科院果樹所提供，樣品采集后于 -80 ℃ 凍存?zhèn)溆谩１驹囼?yàn)所使用的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀為 Applied Biosystem 公司 StepOne PlusTM PCR 儀，PCR 管為 Applied Biosystem 公司配套的 8 連管和管蓋。FS Universal SYBR Green Master 試劑盒購(gòu)自 Roche 有限公司，引物由上海英濰捷基有限公司合成。其他常規(guī)試劑分別從北京科百奧生物科技有限公司與金華醫(yī)藥公司購(gòu)買。

1.2 RNA 提取及cDNA 一鏈合成

參照徐昌杰等[18]的改良 Bugos 法提取樣品總 RNA，提取的總 RNA 經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量與濃度。

取 1 μg 總 RNA，參照 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit （Fermentas 公司）使用說明合成 cDNA 一鏈，保存于 -20 ℃ 備用。

1.3 ‘琯溪蜜柚 actin1、 β-tubulin﹑ 18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 內(nèi)參基因片段的克隆

在 NCBI 網(wǎng)站搜索內(nèi)參基因 actin1、β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 序列，選取與柚親緣關(guān)系較近物種的保守序列設(shè)計(jì)引物（表 1），以‘琯溪蜜柚 DAF 165 果實(shí)汁胞 cDNA 一鏈為模板，采用高保真 Taq DNA 聚合酶分別擴(kuò)增上述 5 個(gè)管家基因，并連接至 pEASY-Blunt 平末端克隆載體，獲得的克隆送上海英濰捷基有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 ‘琯溪蜜柚 actin1、 β-tubulin﹑ 18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 內(nèi)參基因 qRT-PCR 引物設(shè)計(jì)

參照實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物設(shè)計(jì)原則，以克隆的 5 個(gè)‘琯溪蜜柚內(nèi)參基因片段為模板，應(yīng)用 Primer Premier 5.0 軟件，設(shè)計(jì) qRT-PCR 反應(yīng)引物（表 2）。

1.5 內(nèi)參基因的 qRT-PCR 分析

qRT-PCR反應(yīng)體系中分別加入2 × SYBR Green 10 μL、10 μmol·L-1 forward primer 0.4 μL、10 μmol·L-1 reverse primer 0.4 μL、cDNA一鏈模板（稀釋15倍）1 μL，添加ddH2O 補(bǔ)足至總反應(yīng)體系 20 μL。每樣品重復(fù)3次。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性 5 min，95 ℃ 3 s，退火及延伸 45 s，40次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析及瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物的特異性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用 EST Database of Cotton 網(wǎng)站（http：//www.leonxie.com/referencegene.php）中內(nèi)參分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)在線處理，該在線軟件共包含 geNorm﹑NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 種內(nèi)參基因評(píng)估方法，對(duì)各個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總 RNA 質(zhì)量檢測(cè)

如圖 1所示，所提取的 RNA條帶清晰明亮，28S RNA 條帶熒光亮度是 18S RNA 條帶的 1.5～2.0 倍，沒有蛋白質(zhì)、多糖、鹽或其他雜質(zhì)的污染，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 內(nèi)參基因片段的克隆

經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證5 個(gè)‘琯溪蜜柚內(nèi)參基因片段均與其他物種對(duì)應(yīng)序列有較高的同源性，表明所克隆片段為‘琯溪蜜柚相應(yīng)的內(nèi)參基因。將獲取的內(nèi)參基因片段序列提交至NCBI 網(wǎng)站，獲取GenBank登錄號(hào)分別為：actin1（JQ248013）、18S rRNA（JQ343046）﹑ EF1-α（JQ353767）和 Ubiquitin（JQ343045），另外 β-tubulin序列已由福建農(nóng)林大學(xué)的Chen和Yang提交至NCBI，序列號(hào)為 JN580588。

2.3 普通RT-PCR預(yù)擴(kuò)增內(nèi)參基因片段

以 DAF 165 果實(shí)汁胞 cDNA 一鏈為模板，應(yīng)用熒光定量 PCR 引物分別擴(kuò)增 actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α 和 Ubiquitin 5 個(gè)內(nèi)參基因片段。如圖 2 所示，5 個(gè)內(nèi)參基因均能擴(kuò)增出特異條帶，與預(yù)期片段大小一致；無引物二聚體，表明引物特異性較好，可用于后續(xù) qRT-PCR 分析。

2.4 qRT-PCR擴(kuò)增內(nèi)參基因片段

以‘琯溪蜜柚果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期汁胞及組織 cDNA 一鏈為模板，進(jìn)行 qRT-PCR 分析。如圖 3 所示，‘琯溪蜜柚 5 個(gè)內(nèi)參基因在不同樣品中溶解曲線均呈單一信號(hào)峰，表明所用引物均能特異地?cái)U(kuò)增相應(yīng)內(nèi)參基因，不存在引物二聚體；并且重復(fù)之間差異?。?Ct 值差異小于1）。同時(shí)，分別對(duì) 5 對(duì)引物的 qRT-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果每對(duì)引物均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異條帶（結(jié)果同圖 2）。上述結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 結(jié)果是準(zhǔn)確可信的，最終取 3 次重復(fù)的平均 Ct 值用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.5 內(nèi)參基因的分析選擇

“EST Database of Cotton”是一在線數(shù)據(jù)庫(kù)，在其“softwares and tools”欄有關(guān)于內(nèi)參基因穩(wěn)定性和變異系數(shù)的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括 geNorm﹑NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 種用于篩選穩(wěn)定的 qPCR 內(nèi)參基因數(shù)據(jù)分析方法。如圖 4 A 所示，除 BestKeeper 法分析 18S rRNA 是相對(duì)較穩(wěn)定的內(nèi)參基因之外，其余3種方法均判斷 actin1 和 β-tubulin 是‘琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因；EF1-α 和 β-tubulin 是‘琯溪蜜柚不同組織中較穩(wěn)定的內(nèi)參基因圖 4 B。

3 討 論

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)現(xiàn)已成為分子生物學(xué)研究的重要工具，要想獲取確實(shí)可信的基因表達(dá)結(jié)果，需要有合理可行的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、嚴(yán)格精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)操作、較高的 RNA 質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率、引物設(shè)計(jì)及正確的數(shù)據(jù)分析等。除此之外，還需選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因。大量的研究結(jié)果表明，不同植物的最合適的內(nèi)參基因均不相同，且同一植物不同組織之間內(nèi)參基因的穩(wěn)定性也存在一定差異。盲目地使用一種管家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能產(chǎn)生錯(cuò)誤甚至相反的結(jié)論[1，7-8]。因此，適宜內(nèi)參基因的選擇應(yīng)取決于研究者的實(shí)驗(yàn)條件，在一種實(shí)驗(yàn)條件下合適的內(nèi)參基因并不一定適用另一種實(shí)驗(yàn)條件，不同植物間內(nèi)參基因也是不同的。在研究目的基因表達(dá)豐度之前，有必要對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并選出適合在不同實(shí)驗(yàn)條件下使用的內(nèi)參基因。理想的內(nèi)參基因應(yīng)滿足以下條件：（1）無假基因；（2）穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞或組織，且表達(dá)水平相近，無顯著性差別；（3）表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似；（4）不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響[7，19-20]。事實(shí)上，所有基因在不同細(xì)胞或組織中、細(xì)胞的不同生理時(shí)期、不同外界刺激條件下，其表達(dá)豐度都會(huì)有所改變，甚至是幾十倍、上百倍的差異[8，19]。

另外，不同的評(píng)估方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有一定的影響，需運(yùn)用多種分析方法綜合評(píng)估以確保準(zhǔn)確性。在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用 geNorm﹑NormFinder﹑comparative Delta-CT 和 BestKeeper 4 種數(shù)據(jù)評(píng)估方法，分析發(fā)現(xiàn)其中BestKeeper 數(shù)據(jù)評(píng)估結(jié)果與前 3 種方法略有差異，其可能的原因是： 在試驗(yàn)中18S rRNA 表達(dá)量相對(duì)較高，Ct 值顯著低于其他內(nèi)參基因，經(jīng) BestKeeper 分析得出的 CV 值也相對(duì)偏小。由于 geNorm 軟件將每個(gè)候選內(nèi)參基因與其他內(nèi)參基因的配對(duì)表達(dá)水平比值經(jīng)過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，更適用于準(zhǔn)確定量的內(nèi)參數(shù)目[21]。

植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域有大量關(guān)于內(nèi)參基因篩選的研究，其中在模式、經(jīng)濟(jì)作物中研究較多，如擬南芥、水稻、番茄、油菜等[22-25]，也發(fā)現(xiàn)并鑒定出新的一些內(nèi)參基因，如UNK1、MTP、FBOX、PP2A和 rpII 等。至于柑橘類，Mafra等[26]從 15 個(gè)候選基因中發(fā)現(xiàn) FBOX、SAND、GAPC2 和 UPL7 適用于甜橙 （C. sinensis Osbeck） 等 7 種柑橘基因型及生物脅迫處理材料的基因定量分析。嚴(yán)佳文等[27]分析發(fā)現(xiàn) ACTB 在沙田柚 （C. grandis Osbeck） 等 6 種柑橘基因型葉片中表達(dá)較穩(wěn)定，18S rRNA 和 rpII 在花瓣和果皮中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn) β-tubulin 是‘琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期和不同組織中均較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而 actin1 和 EF1-α 則分別適用于‘琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期和不同組織的基因定量分析。

參考文獻(xiàn) References：

[1] BUSTIN S A，BENES V，GARSON J A，HELLEMANS J， HUGGETT J， KUBISTA M， MUELLER R， NOLAN T， PFAFFL M W， SHIPLEY G L， VANDESOMPELE J， WITTWER C T. The MIQE Guidelines： minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments[J]. Clinical Chemistry， 2009， 55： 611-622.

[2] HALLER F， KULLE B， SCHWAGER S， GUNAWAN B， HEYDEBRECK A V， SULTMANN H， FUZESI L. Equivalence test in quantitative reverse transcription polymerse chain reaction： confirmation of reference genes suitable for normalization[J]. Annal Biochemistry， 2004， 335： 1-9.

[3] HEID C A， STEVENS J， LIVAK K J，WILLIAMS P M. Real time quantitative PCR[J]. Genome Research， 1996， 6： 986-994.

[4] KUBISTA M， ANDRADE J M， BENGTSSON M， FOROOTAN A， JONAK J， LIND K， SINDELKA R， SJOBACK R， SJOGREEN B， STROMBOM L， STAHLBERG A， ZORIC N. The real-time polymerase chain reaction[J]. Molecular Aspects of Medicine， 2006， 27： 95-125.

[5] HUGGETT J， DHEDA K， BUSTIN S， ZUMLA A. Real-time RT-PCR normalization； strategies and consideration[J]. Genes and Immunology， 2005， 6： 279-284.

[6] JIAN B， LIU B， BI Y R， HOU W S， WU C X ，HAN T F. Validation of internal control for gene expression study in soybean by quantitative real-time PCR[J]. BMC Molecular Biology， 2008， 9： 59-72.

[7] THELLIN O， ELMOUALIJ B， HEINEN E， ZORZI W. A decade of improvements in quantification of gene expression and internal standard selection[J]. Biotechnology Advances， 2009， 27： 323-333.

[8] GUENIN S， MAURIAT M， PELLOUX J， WUYTSWINKEL O V， BELLINI C， GUTIERREZ L. Normalization of qRT-PCR data： the necessity of adopting a systematic， experimental conditions-specific， validation of references[J]. Journal of Experiment Botany， 2009， 60： 487-493.

[9] XU C J， FRASER P D， WANG W J， BRAMLEY P M. Differences in the carotenoid content of ordinary citrus and lycopene-accumulating mutants[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006a， 54： 5474-5481.

[10] XU J， TAO N G， LIU Q， DENG X X. Presence of diverse ratios of lycopene/β-carotene in five pink or red-fleshed citrus cultivars[J]. Scientia Horticulturae， 2006b， 108： 181-184.

[11] TAO N G， XU J， CHENG Y J， DENG X X. Lycopene-epsilon-cyclase pre-mRNA is alternatively spliced in Cara Cara navel orange （Citrus sinensis Osbeck）[J]. Biotechnology Letters， 2005， 27： 779-782.

[12] TAO N G， HU Z Y， LIU Q， XU J， CHENG Y J， GUO L L， GUO W W， DENG X X. Expression of phytoene synthase gene （Psy） is enhanced during fruit ripening of Cara Cara navel orange （Citrus sinensis Osbeck）[J]. Plant Cell Reports， 2007， 26： 837-843.

[13] FANCIULLINO A L， DHUIQUE-MAYER C， LURO F， MORILLON R， OLLITRAULT P. Carotenoid biosynthetic pathway in the citrus genus： number of copies and phylogenetic diversity of seven genes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55： 7405 -7417.

[14] ALQUEZAR B， RODRIGO M J， ZACARIAS L. Regulation of carotenoid biosynthesis during fruit maturation in the red-fleshed orange mutant Cara Cara[J]. Phytochemistry， 2008， 69： 1997-2007.

[15] PAN Z Y， LIU Q， YUN Z， GUAN R， ZENG W F， XU Q， DENG X X. Comparative proteomics of a lycopene-accumulating mutant reveals the important role of oxidative stress on carotenogenesis in sweet orange （Citrus sinensis osbeck）[J]. Proteomics，2009， 9： 5455 -5470.

[16] YE J L， ZHU A D， TAO N G， XU Q， XU J， DENG X X. Comprehensive analysis of expressed sequence tags from the pulp of the red mutant Cara Cara navel orange （Citrus sinensis Osbeck）[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2010， 52： 856-867.

[17] ZENG Y L， PAN Z Y， DING Y D， ZHU A D， CAO H B， XU Q， DENG X X. A proteomic analysis of the chromoplasts isolated from sweet orange fruits （Citrus sinensis Osbeck）[J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62： 5297-5309.

[18] XU Chang-jie， CHEN Kun-song， ZHANG Bo， WANG Qian-jie， YE Wei-jia. A study on methods for RNA extraction from Citrus tissues[J]. Journal of Fruit Science， 2004，21： 136-140.

徐昌杰， 陳昆松， 張波， 王錢潔， 葉薇佳. 柑橘組織RNA提取方法研究[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2004， 21： 136-140.

[19] HU Rui-bo， FAN Cheng-ming， FU Yong-fu. Reference gene selection in plant real-time quantitative reverse transcription PCR （qRT-PCR）[J]. Journal of Agricultural Science and Technology， 2009， 11： 30-36.

胡瑞波， 范成明， 傅永福. 植物實(shí)時(shí)熒光定量 PCR內(nèi)參基因的選擇[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)， 2009， 11： 30-36.

[20] HENDRIKS-BALK M C， MICHEL M C， ALEWIJNSE A E. Pitfalls in the normalization of real-time polymerase chain reaction data [J]. Basic Research in Cardiology， 2007， 102： 195-197.

[21] VANDESOMPELE J， KUBISTA M， PFAFFL M W. Reference gene validation software for improved normalization[C]. Real-time PCR： Current Technology and Applications， 2009： 47-63.

[22] HONG S M， BAHN S C， LYU A， JUNG H S， AHN J H. Identification and testing of superior reference genes for a starting pool of transcript normalization in arabidopsis[J]. Plant and Cell Physiology， 2010， 51： 1694-1706.

[23] KIM B R， NAM H Y， KIM S U， KIM S I， Y J. Normalization of reverse transcription quantitative-PCR with housekeeping genes in rice[J]. Biotechnology Letters， 2003， 25： 1869-1872.

[24] LΦ？譈VDAL T， LILLO C. Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in tomato subjected to nitrogen， cold，and light stress[J]. Analytical Biochemistry， 2009， 387： 238-242.

[25] CHEN X， TRUKSA M， SHAH S， WESELAKE R J. A survey of quantitative real-time polymerase chain reaction internal reference genes for expression studies in Brassica napus[J]. Analytical Biochemistry， 2010， 405： 138-140.

[26] MAFRA V， KUBO K S， ALVES-FERREIRA M， RIBEIRO-ALVES M， STUART R M， BOAVA L P， RODRIGUES C M， MACHADO M A. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions[J]. PLoS ONE， 2012， 7： e31263.

[27] YAN Jia-wen，YUAN Fei-rong，LONG Gui-you，TAN Lei， DENG Zi-niu. Selection and expression stability of reference genes in different citrus species[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2010， 37（Suppl.）： 2098.

嚴(yán)佳文，袁飛榮，龍桂友，覃磊，鄧子牛. 柑橘內(nèi)參基因的篩選及其表達(dá)穩(wěn)定性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2010， 37（增刊）： 2098.