柑橘全爪螨代謝抗性相關基因表達差異分析

冉春　張云飛　陳飛　劉浩強　李鴻筠　胡軍華　姚廷山

摘 要： 【目的】為了明確谷胱甘肽S-轉移酶（GST）基因、羧酸酯酶（CarE）基因，過氧化氫酶（CAT）基因在柑橘全爪螨Panonychus citri抗性中的作用，【方法】在室內用噻螨酮對柑橘全爪螨進行抗性選育，進一步構建抗/敏品系數(shù)字基因表達譜，采用RPKM法對柑橘全爪螨敏感品系和噻螨酮抗性品系3種代謝抗性相關基因進行表達差異分析?！窘Y果】經(jīng)過20代抗性選育，獲得了柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系，與敏感品系比較，柑橘全爪螨對噻螨酮的抗性倍數(shù)達到3 532.12倍?；虿町愋苑治霭l(fā)現(xiàn)，抗性品系中有11條GST基因、17條CarE基因和6條 CAT基因表達上調；14條GST基因、24條CarE基因和3條 CAT基因表達下調。上調倍數(shù)最高的GST基因、CarE基因和CAT基因分別為Unigene31530 [log2 ratio（RS/SS）=1.05]、Unigene23121 [log2 ratio（RS/SS）=2.05]和Unigene31477 [log2 ratio（RS/SS）=10.04]。進一步對Unigene31477進行熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，抗性和敏感品系基因表達水平?jīng)]有顯著差異?！窘Y論】根據(jù)柑橘全爪螨抗/敏性品系基因表達差異推斷，GST、CarE和CAT基因可能與柑橘全爪螨對噻螨酮產(chǎn)生的抗性沒有密切關系。

關鍵詞： 柑橘全爪螨； 噻螨酮； 抗性品系； 敏感品系； 代謝酶； 基因表達差異

中圖分類號：S666 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0022-06

柑橘全爪螨Panonychus citri （McGregor）又名柑橘紅蜘蛛，屬蜘蛛綱蜱螨目葉螨科，是一種世界廣泛分布的重要害螨。柑橘全爪螨主要吸食柑橘葉片、嫩梢、花蕾和果實汁液，嚴重時引起落葉、落花、落果，造成減產(chǎn)?；瘜W防治仍是控制柑橘全爪螨最有效的措施，但由于其個體小、世代多、繁殖力強，對藥劑極易產(chǎn)生抗性。目前，柑橘全爪螨已對大多數(shù)登記的有機磷、菊酯類殺螨劑產(chǎn)生了抗性[1-4]，專用殺螨劑抗性也極其突出[5-6]。噻螨酮屬噻唑烷酮類低毒選擇性專用殺螨劑，對柑橘全爪螨卵、幼螨、若螨活性極強，是低溫下防治柑橘全爪螨的理想產(chǎn)品，在許多柑橘主產(chǎn)國廣泛應用[7-8]。由于施用不當，柑橘全爪螨對噻螨酮已產(chǎn)生嚴重的抗性[9]，因而有必要建立其科學的抗性治理策略。弄清抗性機理是進行抗性治理的基礎。

水解酶和保護酶活性增強是昆蟲（螨類）對殺蟲（螨）劑產(chǎn)生抗性的重要機制[10-11]，而基因的上調是3種代謝酶活性增強最直接的原因，因此，弄清代謝抗性相關基因表達差異是深入研究昆蟲（螨類）抗性分子機理的重要途徑。鑒于此，筆者通過室內選育，獲得了柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系，進一步探討了抗性和敏感品系之間谷胱甘肽S-轉移酶（GST）基因、羧酸酯酶（CarE）基因，過氧化氫酶（CAT）基因的表達差異，旨在弄清柑柑橘全爪螨抗性與3種代謝抗性相關基因表達差異的關系，從而明確柑橘全爪螨抗性產(chǎn)生可能的分子機理，為抗性治理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蟲源：柑橘全爪螨于2005年采自中國農業(yè)科學院柑桔研究所多年未施用藥劑的檸檬上，后經(jīng)室內不接觸藥劑連續(xù)飼養(yǎng)至今，視為相對敏感品系。柑橘全爪螨飼養(yǎng)溫度為（25±1） ℃、相對濕度為70% ～80%，光周期L∶D =14 h∶10 h。

供試藥劑：50 g·L-1噻螨酮（hexythiazox）乳油，日本曹達株式會社生產(chǎn)。

1.2 柑橘全爪螨的生物測定

采用聯(lián)合國糧農組織推薦的玻片浸漬法[12]。在預備試驗的基礎上，在柑橘全爪螨雌成螨死亡率20%～90%內按等比級數(shù)將供試藥劑分別配成5～7個濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。處理時將雙面膠帶剪成3 cm長貼在載玻片的一端，用細毛筆挑起健康雌成螨，背部貼在膠帶上，每塊載玻片60頭，每處理重復5次，共300頭。將載玻片分別浸入藥液，輕輕搖動5 s后取出，用吸水紙吸凈螨體多余的藥液，在室溫下晾干，15 min后放入光照培養(yǎng)箱（溫度（25±1） ℃，相對濕度為70%～80%，光周期L∶D =14∶10），24 h后在雙筒解剖鏡下分別觀察死、活螨數(shù)，以清水處理為對照。

1.3 柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系選育

柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系從敏感品系選育而來。測定敏感品系（F0）對噻螨酮的敏感基線，然后以殺死品系70%～90%的噻螨酮濃度處理成螨，記錄存活數(shù)量，存活個體繼續(xù)飼養(yǎng)和藥劑汰選，選擇壓力相近，每隔2代測定1次LC50（方法同1.2），觀察抗性增長速度。

1.4 柑橘全爪螨代謝抗性相關基因差異性分析

谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）、過氧化氫酶（CAT）的基因信息從本課題組柑橘全爪螨轉錄組數(shù)據(jù)庫獲得[13]?；虮磉_譜文庫構建參照Wang等[14]的方法 ，采用TRIzol試劑盒分別提取柑橘全爪螨噻螨酮抗/敏品系約10 μg總RNA，經(jīng)質量分析合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入fragmentation buffer使其成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，分別合成cDNA第1鏈和第2鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復、加堿基A和測序接頭，回收目的大小片段，并進行PCR擴增，完成整個文庫制備工作，構建好的文庫用Illumina HiSeqTM 2000進行測序。測序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉化為序列數(shù)據(jù)，去除雜質后得到clean reads，使用短reads比對軟件SOAPaligner/soap[15]將clean reads分別比對到參考基因組和參考基因序列，利用唯一比對上基因的reads數(shù)目和比對上參考序列的總reads數(shù)來計算基因表達量（reads per kb per million reads， RPKM）[16]，其公式為：

設RPKM（A）為基因A的表達量，則C為唯一比對到基因A的reads數(shù)，N為唯一比對到參考基因的總reads數(shù)，L為基因A的堿基數(shù)。RPKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因表達差異。

1.5 柑橘全爪螨不同品系CAT基因定量分析

采用實時熒光定量PCR 方法測定柑橘全爪螨抗性和敏感品系CAT 基因的相對表達量。應用Primer5.0軟件設計引物，前引物為：GTACCTTTTCCGTTGATGGTTC，后引物為：GTGGCCTTTGAAACACTTTCC，以ELF1A[17]為內參基因，在Bio-Rad icycler iQ分析系統(tǒng)上進行操作，反應條件如下：95 ℃預變性30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)。實驗重復3 次。反應結束后收集Ct 值，基因的相對表達量采用2-△△C法[18]進行計算。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應用Abbott公式計算校正死亡率。所得數(shù)據(jù)用SAS（6.12）統(tǒng)計軟件計算毒力回歸方程，致死中濃度LC50及其95%置信度以及相關系數(shù)等參數(shù)，采用卡方（χ2）檢驗毒力回歸方程真實性。

2 結果與分析

2.1 柑橘全爪螨對噻螨酮的抗性選育

柑橘全爪螨抗性選育結果見圖1。以70%～90%的死亡率作為選擇壓力，經(jīng)過20代抗性選育，LC50由選育前的0.05 mg·L-1上升到197.79 mg·L-1，抗性倍數(shù)達3 532.12，柑橘全爪螨對噻螨酮抗性發(fā)展總體上非常迅速。前4代、第7代至第12代、第19代至第20代抗性發(fā)展相對較慢，而抗性發(fā)展較迅速的主要有2個階段，第1階段為第5代至第6代，第2階段為第13代至第18代。第20代后的抗性發(fā)展狀況還需進一步觀察和研究。

2.2 柑橘全爪螨GST基因表達差異分析

通過BLAST搜索比對，從柑橘全爪螨轉錄組中鑒定出25條相似度較高的GST基因（E-value， le-5，下同）（表1），通過進一步差異性分析發(fā)現(xiàn)，抗性品系中有11條GST基因表達上調，14條GST基因表達下調，其中Unigene31530上調倍數(shù)最高[log2 ratio （RS/SS）為1.05]，Unigene18331下調倍數(shù)最高[log2 ratio（RS/SS）為-10.37]，其他GST基因上調或下調的倍數(shù)介于[-2

2.3 柑橘全爪螨羧酸酯酶基因表達差異分析

對鑒定出的39條相似度較高的CarE基因進行差異性分析（表2），抗性品系中有17條CarE基因表達上調，22條CarE基因表達下調，下調基因數(shù)多于上調基因數(shù)，其中Unigene23121上調倍數(shù)最高[log2 ratio （RS/SS）為2.05]，Unigene30172下調倍數(shù)最高[log2 ratio（RS/SS）為-11.52]，其次為Unigene9042[log2 ratio（RS/SS）為-9.72]，其他CarE基因上調或下調的倍數(shù)相對較低[-3

2.4 柑橘全爪螨過CAT基因表達差異分析

對鑒定出的9條相似度較高的CAT基因進行差異性分析（表3），抗性品系中有6條表達上調，3條表達下調，上調基因數(shù)明顯多于下調基因數(shù)，其中U（nigene31477上調倍數(shù)最高[log2 ratio （RS/SS）達到了10.04]，Unigene9876下調倍數(shù)最高[log2 ratio（RS/SS）為-0.56]，其他過氧化氫酶基因上調或下調的倍數(shù)介于[-0.38≤log2 Ratio（RS/SS） ≤1.05]。進一步對Unigene31477進行熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，抗性品系和敏感品系基因表達水平?jīng)]有顯著差異（圖2）。

3 討 論

噻螨酮由于對葉螨卵和若螨具有特殊防效而被廣泛用于柑橘全爪螨的防治，但由于長期單一使用，柑橘全爪螨極易對其產(chǎn)生抗性。在日本，連續(xù)使用6年的果園，LC50 由25 mg·L-1上升至 9 000 mg·L-1；研究者在田間進一步通過對相對敏感品系施用噻螨酮連續(xù)17 次篩選，再經(jīng)室內連續(xù)6 代篩選后，柑橘全爪螨抗性倍數(shù)高達到23 000倍[19-20]。本研究使用噻螨酮對橘全爪螨進行20代抗性選育，LC50由選育前的0.05 mg·L-1上升到197.79 mg·L-1，抗性倍數(shù)達3532.12，抗性發(fā)展極其迅速，達到了極高水平抗性。鑒于此，柑橘全爪螨防治過程中必須高度重視其抗藥性，生產(chǎn)上可選用其他作用機制不同的殺螨劑與之輪用，以控制噻螨酮年使用次數(shù)。

已有的生化機理研究表明，柑橘全爪螨對專用殺螨的抗性可能與GST和CarE活性增強有關。陳達榮等[1]報道了柑橘全爪螨體內CarE的活性與有機磷類藥劑的抗性呈正相關。陳年春等[2]研究發(fā)現(xiàn)GST解毒活性的增強可能是柑橘全爪螨對水胺硫磷產(chǎn)生抗性的主導機制，CarE代謝能力的增強可能是柑橘全爪螨對甲氰菊酯產(chǎn)生抗性的重要原因。孟和生等[21]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘全爪螨體內GST活性的提高是其對噠螨靈產(chǎn)生抗性的重要原因。Ran等[22]通過研究發(fā)現(xiàn)，柑橘全爪螨對噻螨酮的抗性與體內CarE的活力增加有關。Niu等[23]報道GST活性與柑橘全爪螨不同田間種群藥劑敏感性有一定關系。本研究通過分析柑橘全爪螨敏感品系和噻螨酮抗藥品系GST和CarE基因表達差異發(fā)現(xiàn)，抗藥品系中有11條GST基因和17條CarE基因表達上調，但GST基因和CarE基因上調倍數(shù)均不太高，可能與柑橘全爪螨對噻螨酮的抗性關系不太密切。

CAT、SOD和POD在昆蟲體內的主要功能是通過協(xié)調作用清除自由基，防御活性氧或其它過氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害。目前已有資料報道保護酶系統(tǒng)活性增強可能與赤擬谷盜和剌蛾等昆蟲的抗藥性有關[11，24]。本研究對柑橘全爪螨數(shù)字基因表達譜比較分析發(fā)現(xiàn)，噻螨酮抗性品系中CAT基因（Unigene31477）上調倍數(shù)極高，但進一步定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，抗性和敏感品系Unigene31477表達水平并不存在顯著差異，2種分析方法出現(xiàn)的結果差異主要是由于高通量測序過程中較高的RDR引起。根據(jù)Unigene31477定量分析結果推斷，CAT基因與柑橘全爪螨對噻螨酮的抗性同樣關系不太密切。