應用2D—DIGE技術分析柑橘衰退病毒誘導的甜橙差異表達蛋白

楊方云　李中安　周常勇　周彥

摘 要：【目的】為了研究柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）誘導甜橙差異表達蛋白的分離和鑒定，【方法】以接種了CTV的甜橙植株為實驗組，健康植株為對照組，利用雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）技術分析CTV誘導的甜橙差異表達蛋白。【結果】以t檢驗P<0.05和相對表達量≥1.5的水平作為判別標準，獲得了91個CTV誘導的差異表達蛋白點，在實驗組中含量高于對照組的蛋白56個，含量低于對照組的蛋白35個。通過MALDI-TOF質譜分析成功鑒定從中選擇的37個蛋白點，其中19個蛋白功能明確，16個為預測或假定具有某種蛋白功能，包括與抗氧化相關的硫氧還蛋白、鐵氧還蛋白、超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化酶，與代謝相關的磷酸甘油酸酯水解酶、木葡聚糖內糖基轉移酶、變味蛋白，分子伴侶熱激蛋白，折疊酶肽酰脯氨酰順反式異構酶，以及與光合代謝相關的蛋白等?！窘Y論】CTV的侵染影響到甜橙各種復雜的生物學過程。

關鍵詞： 柑橘； 衰退病毒； 蛋白； 雙向熒光差異凝膠電泳

中圖分類號：S666 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0016-06

柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）是柑橘生產(chǎn)上具有經(jīng)濟重要性的病毒病，從上世紀30年代起，該病已造成世界上至少1億株柑橘死亡，在我國柑橘產(chǎn)區(qū)也廣泛分布[1]。CTV主要通過感病接穗、苗和蚜蟲傳播，僅用無病毒苗木不能完全控制該病的流行[1]。目前，在基因水平已開展了CTV致病機理的研究，但在蛋白水平的研究還很少，僅有林尤劍等[2]和范旭東等[3]檢測了CTV病程相關蛋白。由于蛋白質是生物體功能的執(zhí)行單元，很多重要的生物學反應，如磷酸化、糖基化修飾等都發(fā)生在蛋白水平上，因此從蛋白組學方面深入探討CTV致病機理具有重要意義。我們以感染柑橘衰退病的甜橙為對象，通過雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）技術分析CTV誘導甜橙差異表達蛋白，可以為CTV致病機制的研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料為同一母樹來源的甜橙實生苗，品種為錦橙（Citrus sinensis L.），其對柑橘衰退病較為敏感。接種用CTV毒源為田間混合株系，均由中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所國家柑橘苗木脫毒中心提供。

1.2 實驗設計

設實驗組為接種CTV后6個月的2 a生甜橙5株，對照組為健康甜橙5株。2組樣品分別由每組中5株甜橙葉片按相同質量混合而成，每組稱量1 g混合樣進行蛋白提取，重復3次。

1.3 蛋白提取

取甜橙葉片樣本，液氮中用研缽磨碎成細粉狀，采用TCA/丙酮法去除雜質，空氣干燥樣品，加入0.5 mL細胞裂解液（7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫尿， 4% CHAPS， 0.2% IPGbuffer），超聲破碎細胞，12 000×g轉速離心45 min，取上清用0.22 μm膜過濾獲得澄清溶液，采用Bradford法[4]定量后按每管100 μg分裝樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 2D-DIGE電泳分析

取用每組蛋白樣品50 μg，分別標記400 pmol的染料分子Cy3和Cy5。分別取實驗組和對照組蛋白樣品各25 μg進行混合，標記400 pmol的染料分子Cy2，作為內標。每塊凝膠同時上樣3種標記樣品，3次重復。選擇pH值3～10 NL膠條，在IPGphor 3等電聚焦儀（GE）中進行等電聚焦，膠條平衡后，采用 12.5%的SDS-PAGE凝膠對蛋白質進行第2向分離。電泳完成后采用Typhoon 掃描儀（GE）對3種熒光分別采集圖像信息，利用 DeCyder 2DTM軟件（GE）對圖像進行處理和分析。

1.5 差異蛋白的質譜鑒定與分析

從制備膠中選擇差異蛋白點，進行凝膠的膠內酶解（Trypsin，20 h），抽提酶解肽段后通過ZipTip脫鹽處理，采用4800型飛行時間質譜儀（ABI）完成MALDI-TOF質譜鑒定。

1.6 蛋白質肽指紋圖譜（PMF）的檢索

采用標準的檢索方法，在MASCOT（http：//www.matrixscience.com/）進行檢索，采用NCBI數(shù)據(jù)庫，設置參數(shù)：Missed Cleavages為1，Mass Tolerance為 ± 0.8 Da，F(xiàn)ixed modifications為Carbamidomethyl （C）。

2 結果與分析

2.1 CTV甜橙葉中差異蛋白2D-DIGE圖譜分析

實驗組和對照組經(jīng)熒光染料標記后共6例樣品進行雙向電泳分離，在3張凝膠上獲得9幅不同熒光DIGE圖譜，圖版-A～E為其中一張凝膠上獲取的3幅膠圖和疊加圖譜。從圖上可看出，各蛋白質點分離清晰，無明顯雜質干擾和拖尾現(xiàn)象。應用DeCyder 2DTM軟件對獲得的9幅凝膠圖譜進行膠內差異分析和凝膠間比較分析，以t-test 檢驗P<0.05 并且相對表達量差異在1.5倍水平以上（Relative Average Ratio≥1.5）作為判別差異蛋白的標準，共發(fā)現(xiàn)91個差異蛋白點，其中實驗組較對照組上調的蛋白有56個，下調的蛋白有35個（表1）。

2.2 MALDI-TOF MS質譜分析

從發(fā)現(xiàn)的91個差異蛋白點中選擇分離明顯的37個蛋白點進行MALDI-TOF MS質譜鑒定，圖1顯示37個蛋白點在凝膠上的分布情況。分析結果發(fā)現(xiàn)，37個差異蛋白的PMF圖譜信號均較為明顯，信噪比較高。利用Data explore軟件對這些蛋白的PMF圖譜進行處理，以及NCBI數(shù)據(jù)庫搜索，37個蛋白均得到成功鑒定，可信度C.I.%得分超過95%。以蛋白點1為例，檢測到信號強度超過30%的肽段峰23個（圖2），數(shù)據(jù)檢索結果顯示蛋白得分為77，C.I.%得分99.77%，通過軟件預測的等電點和分子量與圖譜中的顯示均相近。表2中列出了匹配峰值的氨基酸序列信息。

2.3 CTV甜橙葉中相關差異蛋白的鑒定

在選擇鑒定的37個蛋白點中，均有相關基因序列的報道，其中19個蛋白功能明確，16個為預測或假定具有某種蛋白功能，2個假定蛋白功能尚不完全清楚（表3）。這些蛋白涉及到許多生物學反應，如與光合代謝有關的核酮糖磷酸羧化酶/加氧酶大小亞基、捕光葉綠素a/b結合蛋白前體、放氧蛋白，與抗氧化相關的硫氧還蛋白、鐵氧還蛋白、超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化酶，與代謝相關的磷酸甘油酸酯水解酶、木葡聚糖內糖基轉移酶、變味蛋白，以及分子伴侶熱激蛋白、折疊酶肽酰脯氨酰順反式異構酶等，這有利于對CTV與寄主互作機制的認識。

3 討 論

研究通過檢索蛋白質數(shù)據(jù)庫生物學信息，鑒定出11個差異表達蛋白與甜橙上CTV誘導密切相關。其中，硫氧還蛋白、抗壞血酸過氧化酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）屬于抗氧化活性酶類，在植物抗病調控清除活性氧自由基中起到積極作用。在Sweat等[5]和Hong等[6]的研究中發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白對植物病害具有抑制作用，病害脅迫還顯著誘導寄主植物大量表達抗壞血酸過氧化酶[7-8]和超氧化物歧化酶[9-10]。本研究中這3種蛋白表達在感染CTV的甜橙上均顯著上調，表明感病甜橙啟動了抗病調控活動，通過表達抗氧化蛋白以增強自身抗病性。

鐵氧還蛋白-NADP+還原酶（FNR）是一種影響植物各種營養(yǎng)代謝活動的重要酶類，它催化還原型鐵氧還蛋白和NADP+ 生成氧化型鐵氧還蛋白和 NADPH，產(chǎn)物NADPH參與了植物的多種營養(yǎng)代謝，感病植物中FNR表達顯著上調[11-12]。本研究也得出相同結果，說明寄主植物受到病原的侵染后會主動上調表達FNR，增強營養(yǎng)代謝活動以對抗病原的傷害。

木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶（XTHs）介導初生細胞壁中β（1-4）-木葡聚糖的裂解和聚合，在木葡聚糖交聯(lián)的形成和重構中發(fā)揮重要作用。它作為一種細胞壁修飾蛋白，在植物生長和發(fā)育過程中參與細胞壁的修飾過程。Cristafni-Yaly等[13]和Albrecht等[14]通過轉錄組與EST序列分析結果與本研究均發(fā)現(xiàn)感病植物上木葡聚糖內糖基轉移酶表達顯著上調，說明病原侵染可誘導寄主木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶活性，對病原入侵產(chǎn)生抵抗作用。

甘油酸酯水解酶，又稱烯醇化酶（enolase），存在于植物所有組織器官中，在糖酵解作用中將2-磷酸甘油酸催化生成一種稱為磷酸烯醇式丙酮酸的高能磷酸分子，它對植物生長發(fā)育的能量代謝非常重要。當植物受到病原侵染后，甘油酸酯水解酶的表達會因不同寄主出現(xiàn)明顯下調[15-16]或上調[17]。本研究均發(fā)現(xiàn)CTV誘導甜橙甘油酸酯水解酶表達顯著上調，與Cristofani-Yaly等[13]研究結果一致。

異檸檬酸脫氫酶（IDH）是一類在三羧酸循環(huán)中起重要作用的酶家族，它催化第三步異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸，反應脫下的氫由NAD（P）+接受生成NAD（P）H，影響著植物體糖、脂肪和蛋白質的代謝。最近研究發(fā)現(xiàn)病原侵染植物將引起異檸檬酸脫氫酶表達顯著下調，異檸檬酸脫氫酶還是病原寄主互作中的氧化還原信使[18]。本研究病株上異檸檬酸脫氫酶表達顯著下調，可能對病株的營養(yǎng)代謝產(chǎn)生抑制和充當病害入侵信使。

熱激蛋白（HSP）是一大類分子伴侶蛋白，能夠通過與抗性蛋白互作起到調控病害抗性的作用[19]。Martinelli等[20]研究發(fā)現(xiàn)HLB侵染誘導甜橙上熱激蛋白表達顯著下調，本研究結果也顯示出CTV誘導甜橙多個熱激蛋白點表達明顯下調，推測可能引起了寄主蛋白的錯折疊。

除了上述幾種差異蛋白外，CTV還引起肽酰脯氨酰順反式異構酶、變味蛋白、核酮糖 1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大小亞基、腺苷酸激酶、放氧復合物增強子蛋白、捕光葉綠素a/b結合蛋白前體、類葉綠素蛋白、類囊體內腔蛋白、似植物乳膠蛋白等的顯著上調或下調表達?？梢奀TV的侵染影響到寄主各種復雜的生物學過程，其致病機理還有待進一步研究。（本文圖版見插2）

參考文獻 References：

[1] ZHOU Yan， ZHOU Chang-yong， SONG Zhen， LIU Ke-hong， YANG Fang-yun. Characterization of citrus tristeza virus isolates by indicators and by molecular biology methods[J]. Agricultural Sciences in China， 2007， 6（5）： 101-105.

[2] LIN You-jian， RUNDELL P A， XIE Lian-hui， POWELL C A. Detection of a pathogenesis-related protein associated with citrus tristeza virus infection in mexican lime plants[J]. Journal of Fujian Agricultural University： Natural Science Edition， 2000， 29（2）： 187-192. 林尤劍， Rundell P A， 謝聯(lián)輝， Powell C A. 感染柑橘速衰病毒的墨西哥酸橙病株中病程相關蛋白的檢測[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學學報： 自然科學版， 2000， 29（2）： 187-192.

[3] FAN Xu-dong， WANG Cai-xia， YE Gang， WANG Guo-ping， HONG Ni. Effect of citrus tristeza virus on the expresion of isozymes and sour pathogenesis-related proteins in citrus plants[J]. Journal of Fruit Science， 2010， 27（1）： 77-81.

范旭東， 王彩霞， 葉剛， 王國平， 洪霓. 柑橘衰退病毒侵染對寄主植物同工酶及酸性病程相關蛋白表達的影響[J]. 果樹學報， 2010， 27（1）： 77-81.

[4] PERI S， STEEN H， PANDEY A. GPMAW-a software tool for analyzing proteins and peptides[J]. Trends Biochem Science， 2001， 11： 687 -689.

[5] SWEAT T A J. WOLPERT T. Thioredoxin h5 is required for victorin sensitivity mediated by a cc-nbs-lrr gene in arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2007， 19： 673-687.

[6] HONG J K， YUN B-W， KANG J-G， RAJA M U， KWON E， SORHAGEN K， CHU C， WANG Y， LOAKE G J. Nitric oxide function and signalling in plant disease resistance[J]. Journal of Experimental Botany， 2008， 59（2）： 147-154.

[7] GULLNER G， FODOR J， JOZSA A， GABORJANY R， KLRALY Z. Responses of the ascorbate-glutathione cycle to necrotic virus infections in tobacco[J]. Phyton （Austria） Special issue： Free Radicals， 1997， 37： 95-100.

[8] SARKAR T S， BHATTACHARJEE A， MAJUMDAR U， ROY A， MAITI D， GOSWAMY A M， GHOSH S K， GHOSH S. Biochemical characterization of compatible plant-viral interaction-a case study with a begomovirus-kenaf host-pathosystem[J]. Plant Signaling & Behavior， 2011， 6（4）： 501-509.

[9] ZHOU W， EUDES F， LAROCHE A. Identification of differentially regulated proteins in response to a compatible interaction between the pathogen fusarium graminearum and its host， triticum aestivum[J]. Proteomics， 2006， 6： 4599-4609.

[10] EBEL R C， KUMAR N. Interference of oxidative metabolism in citrus by xanthomonas citri pv citri[C]. Oxidative stress-environmental induction and dietary antioxidants，2012： 169-188.

[11] JONES A M E， THOMAS V， BENNETT M H， MANSFIELD J， GRANT M. Modifications to the arabidopsis defense proteome occur prior to significant transcriptional change in response to inoculation with pseudomonas syringae[J]. Plant Physiology， 2006， 142： 1603-1620.

[12] TONDO M A L， MUSUMECI M A A， DELPRATO M A L， CECCARELLI E A， G.ORELLANO E. Structural-functional characterization and physiological significance of ferredoxin-nadp+ reductase from xanthomonas axonopodis pv. Citri[J]. PLoS ONE， 2011， 6（11）： 1-11.

[13] CRISTOFANI-YALY M， BERGER I J， TARGON M L P N， TAKITA M A， DORTA S D O， FREITAS-AST A J， SOUZA A A D， BOSCARIOL-CAMARGO R L， REIS M S， MACHADO M A. Differential expression of genes identified from poncirus trifoliata tissue inoculated with CTV through EST analysis and in silico hybridization[J]. Genetics and Molecular Biology， 2007， 30（3 Suppl.）： 972-979.

[14] ALBRECHT U， BOWMAN K D. Gene expression in citrus sinensis （l.） osbeck following infection with the bacterial pathogen candidatus liberibacter asiaticus causing huanglongbing in florida[J]. Plant Science， 2008， 175： 291-306.

[15] DAHAL D， PICH A， BRAUN H P， WYDRA K. Analysis of cell wall proteins regulated in stem of susceptible and resistant tomato species after inoculation with ralstonia solanacearum： A proteomic approach[J]. Plant Mol Biol， 2010， 73： 643-658.

[16] ADI M， JENS P， BROTMAN Y， MIKHAIL K， IRIS S， HENRYK C， RENA G. Stress responses to tomato yellow leaf curl virus （tylcv） infection of resistant and susceptible tomato plants are different[J]. Metabolomics， 2012（1）： 1-13.

[17] CAMPOS A， COSTA G D， COELHO A V， FEVEREIRO P. Identification of bacterial protein markers and enolase as a plant response protein in the infection of olea europaea subsp. Europaea by pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi[J]. Eur J Plant Pathol， 2009， 125： 603-616.

[18] MHAMDI A， MAUVE C， GOUIA H， SAINDRENAN P， HODGES M， NOCTOR G. Cytosolic nadp-dependent isocitrate dehydrogenase contributes to redox homeostasis and the regulation of pathogen responses in arabidopsis leaves[J]. Plant， Cell & Environment， 2010， 33： 1112-1123.

[19] FEBRES V J， KHALAF A， JR. F G G， MOORE G A. Production of disease resistance in citrus by understanding natural defense pathways and pathogen interactions[J]. Tree and Forestry Science and Biotechnology， 2009， 3（2）： 30-39.

[20] MARTINELLI F， URATSU S L， ALBRECHT U， REAGAN R L， PHU M L， BRITTON M， BUFFALO V， FASS J， LEICHT E， ZHAO W， LIN D， D'SOUZA R， DAVIS C E， BOWMAN K D， DANDEKAR A M. Transcriptome profiling of citrus fruit response to huanglongbing disease[J]. PLoS ONE， 2012， 7（5）： 1-16.