基于SSR標(biāo)記的清涼峰地區(qū)三葉海棠遺傳多樣性研究

萍　宗宇　劉晶　胡春云　滕元文

摘 要： 【目的】評(píng)價(jià)清涼峰地區(qū)三葉海棠的遺傳多樣性水平，為其保護(hù)提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷?0對(duì)SSR引物，對(duì)清涼峰地區(qū)的36份三葉海棠樣品進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并從中隨機(jī)抽取6，9，12，15，18，27，34株大小不同的樣本，組成7個(gè)群體進(jìn)行遺傳多樣性特征比較?！窘Y(jié)果】（1）10對(duì)引物在36份樣品中的多態(tài)性等位基因數(shù)（Na）平均值為7.1（5.0～10.0），有效等位基因數(shù)（Ne）平均值為3.954（1.527～5.786），平均觀察雜合度（Ho）為0.781（0.194～1.000），平均期望雜合度（He）為0.699（0.345～0.827），香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）平均值為1.458（0.662～1.918）；（2）采用UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)中，很明顯地將36份供試樣品劃分為兩組，與用貝葉斯聚類方法得到的結(jié)果一致，對(duì)三葉海棠所有樣品進(jìn)行的主成分分析進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)果；（3）群體樣本量≥15株時(shí)，樣本量就不會(huì)對(duì)群體內(nèi)遺傳多樣性水平、遺傳一致度及群體內(nèi)等位基因數(shù)目產(chǎn)生明顯的影響?！窘Y(jié)論】清涼峰地區(qū)三葉海棠的遺傳多樣性水平較高，其群體明顯分化為2個(gè)基因源，三葉海棠群體遺傳多樣性研究和種質(zhì)收集保存中的適宜樣本量為≥15株，研究供試樣品可以反映清涼峰地區(qū)三葉海棠遺傳多樣性的總體水平。

關(guān)鍵詞： 三葉海棠； SSR； 遺傳多樣性； 適宜樣本量

中圖分類號(hào)：S661.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪01-0008-08

三葉海棠[Malus sieboldii（Regel）Rehd.]是薔薇科（Rosaceae）蘋(píng)果屬（Malus Mill.）的多年生木本植物，是重要的蘋(píng)果砧木資源[1]。世界地域范圍內(nèi)主要分布在中國(guó)、日本和朝鮮等地。在中國(guó)三葉海棠分布于從南到北的十多個(gè)省區(qū)[2]。位于浙江臨安和安徽績(jī)溪交界處的清涼峰地區(qū)，由于國(guó)家自然保護(hù)區(qū)的設(shè)立，保存了較完整的三葉海棠的自然居群[3]，但迄今為止還缺乏對(duì)其遺傳多樣性的評(píng)價(jià)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記檢測(cè)植物的遺傳多樣性水平，在其他蘋(píng)果屬植物如小金海棠[4]、變?nèi)~海棠[5]、山荊子[6]、新疆野蘋(píng)果[7]、觀賞海棠[8]等都得到了應(yīng)用。然而迄今為止，對(duì)三葉海棠的研究主要集中在其作為蘋(píng)果砧木的抗性生理[1]、營(yíng)養(yǎng)成分和生物學(xué)特性[9]等方面。近年來(lái)，微衛(wèi)星熒光標(biāo)記技術(shù)由于其高度智能化的特點(diǎn)，工作效率高，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確[10]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到遺傳多樣性的研究中[11-12]。為此，研究運(yùn)用微衛(wèi)星熒光標(biāo)記技術(shù)，對(duì)清涼峰地區(qū)的36份三葉海棠樣品的遺傳多樣性進(jìn)行分析，并從中隨機(jī)抽取6，9，12，15，18，27，34株不同大小的樣本量組成7個(gè)群體進(jìn)行遺傳多樣性特征的比較，以期從DNA水平上分析該地區(qū)三葉海棠的遺傳多樣性水平，為今后更加合理地收集和保存三葉海棠種質(zhì)資源提供參考和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試的36份樣品采自位于浙江省臨安市與安徽省績(jī)溪縣交界的清涼峰地區(qū)的三葉海棠自然居群。于春季采集生長(zhǎng)狀況良好植株的健康幼嫩葉片，按采集順序編號(hào)，放入裝有變色硅膠的自封塑料袋中，迅速干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室，用于DNA提取。為了使采集的樣品具有代表性和避免采集植株的遺傳一致性，從居群的某一植株開(kāi)始，散射狀采集而且保證采集單株之間的間隔大于20 m。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用CTAB法[13]從硅膠干燥的葉片中提取總DNA，稀釋到10～30 mg·L-1，儲(chǔ)存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR標(biāo)記 隨機(jī)抽取8個(gè)樣品的DNA用62對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上60 W功率下電泳約2.5 h，電泳后銀染顯色。Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像儀（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）拍照記錄。從62對(duì)SSR引物中篩選出17對(duì)擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的引物，因其中部分引物位于相同的連鎖群上，遺傳距離較近，所以對(duì)位于相同連鎖群的引物進(jìn)行篩選，選出位于不同連鎖群的10對(duì)引物進(jìn)行SSR擴(kuò)增。篩選出的10對(duì)引物包括從蘋(píng)果屬植物中開(kāi)發(fā)的7對(duì)基因組SSR引物： CH02D08、CH01F02、CH03G12、 CH02B10、CH01H01[14]、Hi21e04、Hi02f06[15]，2對(duì)EST-SSR引物： MES122、MES17[16]及梨屬中開(kāi)發(fā)的基因組SSR引物KA14[17]（表1）。為了實(shí)現(xiàn)微衛(wèi)星多態(tài)性的熒光半自動(dòng)檢測(cè)，對(duì)篩選好的引物進(jìn)行熒光修飾，在單向引物的5端加上熒光修飾基團(tuán)，熒光引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

PCR體系總體積為15 μL，其中包括模板DNA 10～20 ng，上、下游引物各0.4 μmol·l-1，dNTP 200 μmol·L-1， MgCl2 2.0 mmol·L-1，0.5 U Taq DNA 聚合酶（TaKaRa）。PCR反應(yīng)在Eppendorf公司的96孔Mastercycler Gradient PCR儀上進(jìn)行，其中CH系列引物的反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2.5 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min共4個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)后退火溫度降低1 ℃；然后94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[19]。KA系列引物的反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min共10個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)后退火溫度降低0.5 ℃；然后94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[17]。其余引物的反應(yīng)程序是94 ℃預(yù)變性3 min ，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min，4 ℃保存[16]。對(duì)PCR產(chǎn)物用滅菌后的雙蒸水稀釋，利用MegaBASE 1000測(cè)序系統(tǒng)（Amersham Biosciences）檢測(cè)并測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入軟件Genetic Profile v 1.0（Molecular Dynamics），參照峰值強(qiáng)度及分子內(nèi)標(biāo)的大小，確定微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增片段的區(qū)間，對(duì)片段大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)于出現(xiàn)多峰型的樣品，重新進(jìn)行PCR試驗(yàn)后再確定其片段大小，統(tǒng)計(jì)結(jié)果保存為Excel格式以備后續(xù)分析。

利用遺傳數(shù)據(jù)分析軟件GenAlEx 6.3[20]計(jì)算多態(tài)性等位基因數(shù)（Na），SSR位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne），觀察雜合度（Ho），期望雜合度（He），固定指數(shù)（F）及香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）等遺傳多樣性指標(biāo)。

使用NTSYS pc 2.10e軟件計(jì)算樣品的Jaccard遺傳相似系數(shù)矩陣，按UPGMA法建立36個(gè)供試樣品的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖；并基于樣品間歐氏距離對(duì)36個(gè)樣品進(jìn)行主成分分析（PCA）并進(jìn)行二維作圖[21]。

使用STRUCTURE version 2.3.3進(jìn)行貝葉斯聚類[22]，分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)并確定最佳的群體分組。首先設(shè)定K=1～5，設(shè)定Burn-in周期為100 000，MCMC的重復(fù)次數(shù)為100 000次，采用混合模型和相關(guān)等位基因頻率，對(duì)不同的K值進(jìn)行10次重復(fù)運(yùn)行，然后將后綴為“_f”的結(jié)果文件壓縮，上傳到“STRUCTURE HARVESTER”網(wǎng)站（http：//taylor0.biology.ucla.edu/ struct_harvest/），通過(guò)deltaK確定最佳K值[23]。

利用POPGENE version 1.31軟件進(jìn)行三葉海棠不同大小群體量之間遺傳多樣性比較、稀有等位基因數(shù)目的計(jì)算以及聚類分析[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體內(nèi)遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性 10對(duì)引物在36份樣品中的多態(tài)性等位基因數(shù)（Na）從5（CH02B10和KA14）到10（CH01F02），平均等位基因數(shù)為7.1（表2）。每份樣品每對(duì)引物產(chǎn)生2個(gè)相同（單峰）或不同（雙峰）的等位基因。有效等位基因數(shù)（Ne）從1.527（CH02B10）到5.786（CH01F02），平均值為3.954。本研究中觀察雜合度（Ho）為0.194～1.000，平均值為0.781。期望雜合度（He）為0.345～0.827，平均期望雜合度為0.699。Shannon香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）為0.662 ～1.918，平均值為1.458。而固定指數(shù)（F）只有在CH01F02、CH02B10以及MES17中為正值，其余均為負(fù)值，說(shuō)明三葉海棠群體內(nèi)含有較多的雜合子。

2.1.2 聚類分析 基于SSR數(shù)據(jù)對(duì)36份供試樣品進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建親緣關(guān)系樹(shù)狀圖（圖1）。從樹(shù)狀圖的分析可以得出： 在閾值0.60處，36份三葉海棠樣品被分成2組，其中A組包含20份樣品，而B(niǎo)組有16份樣品。在閾值0.79處，A組又被分成3個(gè)亞組，樣品1、13、14、32、33和35，樣品2、10、15、16、18、19、20、22、25、26、28、31和36分別聚成1個(gè)亞組，而樣品21與A組的其他樣品表現(xiàn)出較大的遺傳距離，獨(dú)立成為1個(gè)亞組。B組包括2個(gè)亞組，樣品3表現(xiàn)特殊，單獨(dú)成為1個(gè)亞組。

各供試樣品間的相似系數(shù)介于0.514～1.00，其中樣品18與26，樣品22與36的相似系數(shù)最大（1.00），樣品5與20，3與19及3與20的相似系數(shù)最?。?.514）（數(shù)據(jù)未列出）。

2.1.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 將36個(gè)樣品的K值設(shè)為1～5，進(jìn)行貝葉斯遺傳分析，運(yùn)行5次重復(fù)后，發(fā)現(xiàn)最適K值為2（圖2）。

使用STRUCTURE軟件得到了與UPGMA聚類分析相似的結(jié)果，根據(jù)似然值的對(duì)數(shù)函數(shù)確定最佳類群數(shù)為K=2，當(dāng)K>2時(shí)，同一K值不同運(yùn)行重復(fù)間波動(dòng)幅度非常大。

在K=2的情況下，將36份供試樣品分為2組，以綠色為主的20份供試樣品視為A組，以紅色為主的16份供試樣品視為B組。其中部分樣品表現(xiàn)為2個(gè)基因池的混合，樣品21、32、1、35、33以綠色為主體，構(gòu)成A組中的1個(gè)亞組；樣品8、17和6以紅色為主體，構(gòu)成B組的第1亞組，由于樣品27中紅綠的比例與其他的差別較大，可以認(rèn)為是在B組中獨(dú)立成為第2亞組（圖3）。

對(duì)三葉海棠所有樣品進(jìn)行的主成分分析，進(jìn)一步證實(shí)了以上的結(jié)果，PCA結(jié)果（圖4）顯示，36個(gè)樣品被明顯分成2組，表明三葉海棠之間產(chǎn)生了一定的遺傳分化。在右側(cè)的一組中可以分成2個(gè)亞組，其中樣品21與其他樣品之間有一定的界限。左側(cè)的一組樣品中，樣品27也表現(xiàn)出與其他樣品之間存在一定的差異。

2.2 不同大小樣本量群體的遺傳多樣性分析

2.2.1 不同大小樣本量群體的遺傳多樣性參數(shù)比較

因供試的36株三葉海棠單株的聚類分析中，18與26及22與36的遺傳相似系數(shù)分別為1，所以在下面的研究中去掉了18及22號(hào)樣本，從剩余的34株單株中，隨機(jī)抽取6，9，12，15，18，27，34株組成具有不同樣本數(shù)量的7個(gè)群體進(jìn)行遺傳多樣性的比較（表3）。隨著樣本量的增加，平均等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）呈上升的趨勢(shì)。通過(guò)比較可以看出Control（34）與Ⅰ（6）的差別最大，平均等位基因數(shù)（Na）分別為7.1和4.1，有效等位基因數(shù)（Ne）分別為4.02和3.035，香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）分別為1.472和1.169，表明樣本量的大小影響了群體的遺傳多樣性的分析結(jié)果。但是在樣本量大于15株以后，Ne與對(duì)照組Control（34）的差異不顯著。各群體的觀察雜合度（Ho）隨著樣本量增加有下降的趨勢(shì)，在樣本量大于15株以后Ho表現(xiàn)較小的差異，而期望雜合度（He）在Ⅳ（15）中表現(xiàn)出最大值（0.716）。綜合考慮各群體間的遺傳多樣性參數(shù)，只要保證樣本量不小于15株，樣本量的大小就不會(huì)對(duì)群體內(nèi)遺傳多樣性水平產(chǎn)生明顯的影響。

2.2.2 不同大小樣本量群體的遺傳一致度分析 從各群體的遺傳一致度的程度來(lái)看（表4），與Control（34）的遺傳一致度最大的是Ⅵ（27），遺傳一致度為0.995，最小的是Ⅰ（6），遺傳一致度為0.905。隨著樣本量的增加，遺傳一致度逐漸升高表明樣本量的大小對(duì)遺傳一致度有一定的影響。當(dāng)樣本量大于15株以后，與Control（34）遺傳一致度的差異就不明顯了，所以樣本取樣量大于等于15株就足以代表整個(gè)群體的水平。

2.2.3 稀有等位基因在不同大小樣本量群體內(nèi)的變化分析 稀有等位基因是指群體內(nèi)其基因頻率低于5%的等位基因。群體內(nèi)的遺傳多樣性差異很大程度上是由于稀有等位基因結(jié)合或綜合到基因型背景中。因群體樣本量的不同，會(huì)造成稀有等位基因數(shù)目的增加或缺失，從而造成等位基因數(shù)目的變化。由表5可以看出，Ⅰ（6）和Ⅱ（9）的稀有等位基因數(shù)明顯的低于Control（34），與對(duì)照共有的等位基因數(shù)隨著樣本量的增加呈遞增的趨勢(shì)，而其丟失數(shù)呈遞減的趨勢(shì)。樣本量大于12株以后，稀有等位基因丟失數(shù)目的差異很小，樣本量大于18株以后，群體本身所有的稀有等位基因數(shù)目同與對(duì)照組Control（34）共有的稀有等位基因數(shù)目相等。表明樣本量的大小影響稀有等位基因的數(shù)目，樣本量的增加可以增加稀有等位基因的數(shù)目，從而可以影響等位基因的數(shù)目。

3 討 論

3.1 三葉海棠群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，清涼峰地區(qū)三葉海棠的遺傳多樣性較豐富（He=0.699，I=1.458，Ne=3.954），高于湖北海棠[25] [Malus hupehensis（Pamp.）Rehd.、（He= 0.262 8， I=0.401 5， Ne=1.437 5）]、變?nèi)~海棠[5] [Malus toringoides（Rehd.）Hughes.（He=0.438 9，I=0.628 2，Ne =1.81）]?？赡艿脑蛑皇侨~海棠相比后兩者，無(wú)融合生殖能力較弱[26]，通過(guò)雜交進(jìn)而獲得了較豐富的遺傳變異。與新疆野蘋(píng)果[27] [Malus sieversii（Ledeb.）Roem（He=0.261 9，I= 0.408 2，Ne=1.425 2）]、山荊子[6] [Malus baccata（Linn.）Borkh.（H=0.3386，I= 0.496 1，Ne=1.602 1）]等自交不親和的蘋(píng)果屬植物相比較，三葉海棠的遺傳多樣性也表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平。在野外樣品調(diào)查采集的過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，清涼峰地區(qū)由于設(shè)立自然保護(hù)區(qū)的緣故，三葉海棠的分布未受到明顯的人為破壞，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的世代更迭積累了豐富的遺傳變異，因此表現(xiàn)出較高水平的遺傳多樣性。

STRUCTURE的分析結(jié)果表明，所選36份樣品中存在2個(gè)基因源，部分樣品表現(xiàn)為2個(gè)基因源的混合，其中樣品27表現(xiàn)的更為獨(dú)特。對(duì)三葉海棠UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)36份樣品明顯分為2組，在第1組中，樣品21與其他樣品相似系數(shù)較小，獨(dú)立成為1個(gè)亞組，在第2組中，樣品3獨(dú)立成為1個(gè)亞組。主成分分析（PCA）同樣將36份海棠樣品分成2組，樣品21、27均表現(xiàn)出與各自所在組群的樣品存在一定的差異。由于不同的分析方法所提供的信息量不同導(dǎo)致不同的分析方法產(chǎn)生的結(jié)果并不完全一致。基于清涼峰地區(qū)三葉海棠表現(xiàn)出遺傳結(jié)構(gòu)的混合和2個(gè)基因源存在的事實(shí)，清涼峰地區(qū)的三葉海棠最適合進(jìn)行就地保護(hù)，從而最大程度地保存清涼峰地區(qū)三葉海棠的遺傳多樣性水平。

3.2 三葉海棠群體遺傳多樣性研究中的適宜樣本量

樣本量大小是影響種質(zhì)遺傳多樣性和群體內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)分析的重要因素。三葉海棠作為異花授粉的植物，從理論上講如果群體的樣本量無(wú)限大，那么所有的遺傳特點(diǎn)全部呈現(xiàn)出來(lái)，但在實(shí)際的操作中，由于人力、物力和財(cái)力多方面因素的影響，不可能采集無(wú)限多的樣本量，而樣本量過(guò)小則無(wú)法呈現(xiàn)出研究對(duì)象的遺傳特性；群體內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)要得到完全的體現(xiàn)，稀有等位基因的分布與數(shù)目變化情況就要和整個(gè)群體的保持一致。所以找出一個(gè)適宜群體樣本量，使得所選擇的群體樣本量能代表原始群體的遺傳多樣性水平是至關(guān)重要的。徐重益等[28]在對(duì)菜薹種質(zhì)繁殖群體大小的研究發(fā)現(xiàn)： 大于30株的群體能代表200株整體群體的遺傳多樣性；班霆等[29]在對(duì)苜蓿遺傳多樣性的取樣數(shù)目的研究中表明： 采用40個(gè)單株的DNA混合樣是較適宜的群體大小。本研究通過(guò)隨機(jī)抽樣得到不同大小樣本量的7個(gè)群體，通過(guò)比較各群體的遺傳多樣性參數(shù)、遺傳一致度及不同大小樣本量群體內(nèi)稀有等位基因數(shù)的變化情況，表明只要保證樣本量≥15株，樣本量的大小就不會(huì)對(duì)群體內(nèi)遺傳多樣性水平、遺傳一致度及群體內(nèi)等位基因數(shù)目產(chǎn)生明顯的影響。這與楊軍等[30]在對(duì)杜梨實(shí)生繁殖群體的研究認(rèn)為杜梨種質(zhì)保存、更新的適宜群體量為15株以上的研究結(jié)果相似。因此，在三葉海棠種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究中至少采集15株的樣本量，就可以代表原始群體的遺傳多樣性水平。在遷地保護(hù)時(shí)，也應(yīng)該至少有15株的保存量才能保證其群體遺傳多樣性的完整保存。

綜上所述，浙江省臨安市與安徽省交界的清涼峰地區(qū)的三葉海棠具有較高的遺傳多樣性水平，群體內(nèi)也存在一定程度的遺傳分化。本研究也為三葉海棠遺傳多樣性的保存提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為我國(guó)整個(gè)三葉海棠的遺傳多樣性的評(píng)價(jià)研究提供了借鑒。

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