來(lái)氟米特對(duì)MRL/lpr狼瘡鼠療效及單核細(xì)胞趨化蛋白-1的影響*

袁衛(wèi)東 ，譚 薇 ，夏云飛，曹曉蕾

（1海門(mén)市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 226100；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕科；3南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院）

腎臟是系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus，SLE)最常累及的器官之一。研究表明，單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）作為單核細(xì)胞特異的趨化因子在狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）發(fā)生發(fā)展中起到十分重要的作用。LN腎組織中MCP-1高表達(dá)是單核細(xì)胞浸潤(rùn)的最主要原因，且兩者高度相關(guān)[1-2]。SLE患者尿MCP-1水平活動(dòng)期顯著高于非活動(dòng)期[3]。提示MCP-1/CCL2在LN的發(fā)生發(fā)展中起到十分重要的作用[4-5]。近年來(lái)研究表明來(lái)氟米特（leflunomide,LEF）用于治療LN效果顯著，可使LN患者臨床癥狀、體征及免疫學(xué)指標(biāo)明顯改善[6-7]，但對(duì)其機(jī)制研究目前尚不多見(jiàn)。本文觀察了LEF對(duì)MRL/lpr鼠的作用及其對(duì)MCP-1表達(dá)的影響，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 MRL/lpr狼瘡小鼠16只，雌性，7～8 周齡，體重 20±2g，均飼養(yǎng)于南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF屏障環(huán)境。隨機(jī)分為2組：LEF組（LEF，n=8）、對(duì)照組（Con，n=8）。LEF 組于 16 周予以含LEF(35mg/kg·d)的0.5%羧甲基纖維素水灌胃8周,對(duì)照組予同體積的0.5%羧甲基纖維素水灌胃8周，于第25周處死所有動(dòng)物。

1.2 尿蛋白、抗ds-DNA抗體、血清肌酐測(cè)定 于10、20、24周時(shí)代謝籠留取小鼠24h尿量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定尿蛋白含量。25周時(shí)測(cè)定抗ds-DNA抗體、血清肌酐，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 腎臟病理檢查 將部分腎組織予10%中性甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、HE染色。觀察腎小球數(shù)、腎小球硬化數(shù)、新月體數(shù)、是否存在腎小球血管袢內(nèi)血栓形成及毛細(xì)血管袢壞死等。采用雙盲法觀察每張切片上100個(gè)腎小球中新月體的數(shù)量，計(jì)算新月體形成率，以評(píng)價(jià)LN的嚴(yán)重程度[8]。新鮮腎組織OCT包埋后，切片5μm，直接免疫熒光法檢測(cè)IgG、IgM沉積。

1.4 血液、尿液MCP-1測(cè)定 PBS緩沖液洗板2次，在包被有抗MCP-1單克隆抗體的酶聯(lián)板孔內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或1∶5稀釋待檢樣品，每孔100μL。每孔中加入HRP結(jié)合物50μL；室溫孵育2 h。洗板3次后每孔加入100μL TMB/底物溶液,避光室溫孵育10 min，每孔加入100μL終止液；讀取620 nm波長(zhǎng)處A值。

1.5 Western Bolt測(cè)定腎臟組織MCP-1 新鮮腎組織OCT包埋后，切片5μm，SP法進(jìn)行MCP-1免疫組化。取小鼠腎臟皮質(zhì)組織100mg，充分研磨成粉末狀，加入蛋白酶抑制劑、蛋白質(zhì)裂解緩沖液。離心、取上清液提取抗原，并測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整濃度后加樣電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，加脫脂奶粉封閉，再加入抗鼠MCP-1一抗過(guò)夜，PBS沖洗15min，置于 1∶5000 二抗，室溫反應(yīng) 1h，PBS 沖洗后暗室顯影，待膠片晾干后掃描儀掃描，分析其灰度。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng) （Rt-PCR） 根據(jù)Gen-Bank提供的MCP-1、GAPDH基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物如下：MCP-1正向引物:5'-AGAAACCAGCCAACTC-3'，反向引物:5'-GCTACAGGCAGCAACT-3'，片斷長(zhǎng)度 103bp。GAPDH正向引物:5'-ATCGTGGAAGGGCTAATG-3'，反向引物:5'-GGATGATGTTCTGGTGGG-3'，片斷長(zhǎng)度115 bp。腎臟組織研磨后Trizole法提取mRNA并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280值，計(jì)算RNA含量，使用Rt-PCR Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成CDNA。進(jìn)行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系20μL。內(nèi)含:10μL 2×QuantiTect SYBR Green I RT-PCR Master Mix;上游引物、下游引物(10μmol/μL)各 1μL,0.2μL Quanti-Tect RTMix；模板 1μL;6.8μL 無(wú) RNase水。反應(yīng)條件為：50℃ 20min(×1)，95 ℃ 10min(×1)，94 ℃ 15s →49.5℃ 20s→72℃ 30s(×45)。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。在凝膠成像系統(tǒng)中拍攝照片并予灰度掃描，將目的基因MCP-1與GAPPH的灰度進(jìn)行對(duì)比，所得的比值為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，多個(gè)樣本組間差異性比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LEF對(duì)MRL/lpr鼠24h尿蛋白定量、抗ds-DNA抗體滴度及肌酐的影響 對(duì)照組MRL/lpr鼠從16周齡開(kāi)始，尿蛋白逐漸升高。治療4周后LEF組尿蛋白顯著較對(duì)照組減少。20周時(shí)LEF組尿蛋白水平(1.73±1.32mg)低于對(duì)照組(3.9±2.34mg)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；24周時(shí)，LEF組尿蛋白水平(1.62±1.25mg)顯著低于對(duì)照組(5.75±2.33mg)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。25周時(shí)，LEF組抗 ds-DNA 抗體滴度（39.19±15.77×102 IU/mL）較對(duì)照組（69.96±32.77×102 IU/mL）顯著降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。25周時(shí)，血清肌酐濃度LEF組（6.95±3.37μmol/L）與對(duì)照組（11.50±2.39μmol/L）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 LEF對(duì)MRL/lpr鼠腎臟病理變化的影響 LEF組光鏡下可見(jiàn)：腎小球硬化及間質(zhì)纖維化程度顯著減輕，系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕度到中度增生、局灶性硬化、腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕（圖1）。LEF組新月體形成率（0.11±0.05）顯著較對(duì)照組（0.21±0.07）降低（P＜0.05）。免疫熒光結(jié)果顯示：IgG、IgM 主要沉積于系膜下、上皮上、內(nèi)皮下。LEF組IgG及IgM沉積顯著較對(duì)照組減少（圖2）。對(duì)照組小鼠腎臟光鏡下可見(jiàn)：腎小球硬化，腎小球系膜細(xì)胞大量增殖、系膜基質(zhì)增寬，新月體形成，腎間質(zhì)內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 LEF治療對(duì)MRL/lpr鼠的腎臟病理的影響（HE×300）

圖2 LEF治療對(duì) MRL/lpr鼠的腎臟 IgG、IgM沉積的影響（300×）

2.3 LEF對(duì) MRL/lpr鼠血清、尿液MCP-1的影響25周時(shí)LEF組血清MCP-1水平較對(duì)照組降低 (P＜0.05)。24周時(shí)LEF組尿液MCP-1水平與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表 1。

表1 LEF對(duì)MRL/lpr小鼠血液及尿液MCP-1濃度的影響（，pg/mL）

表1 LEF對(duì)MRL/lpr小鼠血液及尿液MCP-1濃度的影響（，pg/mL）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05

血清MCP-1 尿液MCP-11099.31±391.72 342.70±165.34*對(duì)照組 8 1325.45±352.28 487.72±194.57

2.4 LEF對(duì)MRL/lpr鼠腎臟MCP-1表達(dá)的影響MCP-1主要定位于腎小球系膜區(qū)、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)處腎小管細(xì)胞邊緣和腎小管腔內(nèi)。LEF組MCP-1表達(dá)較對(duì)照組顯著減弱（圖3）。

圖3 LEF治療對(duì)MRL/lpr鼠腎臟MCP-1表達(dá)的影響（SP，1200×）

2.5 LEF對(duì)MRL/lpr鼠腎臟MCP-1蛋白表達(dá)的影響 LEF組腎臟中MCP-1蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LEF組MCP-1相對(duì)表達(dá)量 0.40±0.02，Con組 MCP-1相對(duì)表達(dá)量 0.79±0.15，見(jiàn)圖 4。

圖4 LEF治療對(duì)MRL/lpr鼠腎臟MCP-1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

LEF通過(guò)可逆性抑制嘧啶核苷酸從頭合成途徑的限速酶，從而阻斷限速嘧啶核苷酸的從頭合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)DNA及RNA的合成，抑制T、B淋巴細(xì)胞增生，減少免疫球蛋白產(chǎn)生，LEF還具有抑制蛋白酪氨酸激酶磷酸化的作用[9]。我們研究發(fā)現(xiàn)來(lái)氟米特干預(yù)后可使MRL/lpr小鼠尿蛋白減少，血清肌酐水平降低，腎組織病理改變，提示來(lái)氟米特治療MRL/lpr小鼠LN有效，與Bartlett等[10]報(bào)道一致。

合成和分泌MCP-1的細(xì)胞有多種，其中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞是分泌MCP-1的主要來(lái)源，腎組織內(nèi)的系膜細(xì)胞也可合成和分泌MCP-1[11]。MCP-1是一種低分子量的趨化因子，CCR2是MCP-1的受體，MCP-1與CCR2結(jié)合后可通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞遷移等生物學(xué)行為的改變。體外研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1能誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞的趨化和激活，抗MCP-1抗體能抑制單核巨噬細(xì)胞的趨化與激活[12-13]。MCP-1是LN腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)重要信號(hào)[14]，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞在腎炎中遷移、募集及組織的損傷[15]，促進(jìn)腎間質(zhì)的損害及腎小球新月體形成[16]。表達(dá)MCP-1的MRL/lpr鼠腎小管中聚集有大量巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞，而MCP-1缺陷的MRL/lpr小鼠腎小管中僅有少量T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,且其腎臟病變程度較輕，尿蛋白減少、生存期顯著延長(zhǎng)[5]。Zoja等[17]研究發(fā)現(xiàn)隨著腎炎的進(jìn)展，MRL/lpr鼠MCP-1mRNA的表達(dá)顯著增加，與單核細(xì)胞的浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)。Hitoshi等[18]研究發(fā)現(xiàn)抗MCP-1抗體能夠減輕和延緩MRL/lpr狼瘡鼠LN的發(fā)生和進(jìn)展。這些結(jié)果均提示MCP-1在MRL/lpr鼠LN的形成中起到十分重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)LEF能顯著降低MRL/lpr鼠血清、尿液中MCP-1的表達(dá)，減少腎臟組織中的MCP-1的表達(dá)和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。提示LEF可通過(guò)抑制MCP-1的表達(dá)而發(fā)揮治療LN的作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

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