植物中特定果聚糖的合成研究進(jìn)展

戴曉麗

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Q2006B02) 收稿日期：2013-08-20

作者簡(jiǎn)介：戴曉麗(1989-)，女，山東即墨人，碩士研究生，研究方向：藥物化學(xué),E-mail:dxlqust@163.com。

doi

：10.3969/j.issn.1672-5425.2013.12.004

植物中特定果聚糖的合成研究進(jìn)展

戴曉麗

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

果聚糖，是由多種細(xì)菌和植物產(chǎn)生的一種果糖聚合物，是重要的存儲(chǔ)碳水化合物;菊苣是一種商業(yè)果聚糖生產(chǎn)作物。果聚糖在菊苣體內(nèi)的生物合成是難以控制的。特定果聚糖是原本非果聚糖積累植物引進(jìn)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的成功表達(dá)。較為系統(tǒng)地綜述了果聚糖的生物合成及修改、特定果聚糖的合成、果聚糖的功能及應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展。

果聚糖；植物；菊苣；果糖基轉(zhuǎn)移酶；轉(zhuǎn)基因

果聚糖是由果糖單元和葡萄糖殘基末端組成的聚合物，廣泛存在于生物有機(jī)體(細(xì)菌、某些真菌和約15%的被子植物)中。按糖苷鍵的連接類型果聚糖可劃分為3類：通過β(2-6)鍵連接的聚糖型果聚糖，主要存在于細(xì)菌和單子葉植物中[1]；通過β(2-1)鍵連接的線性菊糖型果聚糖，存在于雙子葉植物中[2]；通過線性β(2-1)鍵連接的果糖基單元連接到蔗糖葡萄糖部分的C1和C6位而成的果聚糖新生混合系列，存在于百合科[3]中。

細(xì)菌利用果聚糖作為能量?jī)?chǔ)存分子[4]和細(xì)胞保護(hù)層。植物病原細(xì)菌利用果聚糖層來阻斷宿主-病原體識(shí)別和抑制衰竭的植物細(xì)胞釋放的抑菌化合物[5]?？谇恢械逆溓蚓霉厶菍幼鳛檎辰觿?。果聚糖在細(xì)菌中的生物合成是由單一酶果糖基轉(zhuǎn)移酶(Fructosyl-transferase,EC2.4.1.10)完成的。在植物中，果聚糖作為一類重要的碳水化合物和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，被存儲(chǔ)在莖、塊莖或根中，在提高植物的抗寒、抗旱乃至抗鹽性能等方面發(fā)揮著重要作用[6]。由于果聚糖生產(chǎn)植物的遺傳多樣性，植物果聚糖鏈長(zhǎng)變化范圍約為10～200個(gè)果糖基單元。與細(xì)菌果聚糖生物合成的單一性相比，植物果聚糖的生物合成由3種不同酶參與：蔗糖:蔗糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase,1-SST，EC 2.4.1.99)、果聚糖：果聚糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Fructan:fructan 1-fructosyltransferase,1-FFT，EC2.4.1.100)和果聚糖外水解酶(Fructan exohydrolase,1-FEH，EC3.2.1.153)。1-SST主要催化兩分子的蔗糖生成等摩爾的1-蔗果三糖(1-Kestose)；1-FFT催化1-蔗果三糖的果糖單元和其它果聚糖分子轉(zhuǎn)化成1-蔗果三糖和較高聚合度(DP)果聚糖分子，當(dāng)使用最短的果聚糖1-蔗果三糖作為果聚糖供體時(shí)，1-FFT可以提高平均聚合度(mDP)；1-FEH通過水解果聚糖單元末端催化菊糖降解,形成果聚糖和低聚合度菊糖[7]。

1 菊苣中果聚糖的生物合成

菊苣是一種商業(yè)化生產(chǎn)菊糖的作物，菊糖被儲(chǔ)存在其主根中，其質(zhì)量的重要參數(shù)之一是聚合物的長(zhǎng)度。菊苣在春季播種，并在同年秋天收獲主根并提取菊糖。收獲時(shí)，菊糖聚合物的平均長(zhǎng)度為9～10，每公頃的平均產(chǎn)量為11 000 kg 碳水化合物。播種7周后伴隨著果聚糖合成酶1-SST和1-FFT的誘導(dǎo)活性，主根開始增厚。1-SST的活性迅速升高，3周后達(dá)到最高[8]。播種10周后活性開始下降，直到11月的生長(zhǎng)季只剩下10%的活性。1-FFT的活性呈現(xiàn)不同的模式，開始時(shí)緩慢上升，于4周后達(dá)到穩(wěn)定[9]。首月由于果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性主要形成短菊糖，播種9周后菊糖分子累積聚合度達(dá)到25。Druart等[8]發(fā)現(xiàn)，菊糖的mDP在9月初達(dá)到最大值(約為16)后開始降低。van den Ende等[9]認(rèn)為，mDP下降的原因是在1-SST存在時(shí)，1-FFT催化下傳入的蔗糖作為果糖單元的受主。在低溫季節(jié)(10月中旬)，由于FEH-I的果聚糖外水解酶活性，mDP進(jìn)一步下降[10]。當(dāng)溫度低于4 ℃時(shí)，可誘導(dǎo)FEH-Ⅱ增強(qiáng)菊糖的降解。1-FFT和1-FEH在秋季的降解催化對(duì)工業(yè)菊糖的生產(chǎn)是很不利的，尤其是對(duì)高聚合度菊糖的生產(chǎn)。從菊苣菊糖生物合成的研究可以得出結(jié)論：1-SST活性下降和1-FEH活性升高都會(huì)對(duì)mDP產(chǎn)生不利影響。為生產(chǎn)高聚合度、高產(chǎn)量的菊糖或改變果聚糖連接型，菊苣中果聚糖合成的修改得到了廣泛關(guān)注。

2 果聚糖生物合成的修改

2.1為得到較高mDP和產(chǎn)量，菊苣中果聚糖生物合成的修改

提高菊苣菊糖mDP的方法主要有兩種：(1)阻止在生長(zhǎng)季節(jié)末期1-SST活性的降低。在生長(zhǎng)季節(jié)內(nèi)源性酶1-SST活性下降，為此Koops等[11]從菊芋中分離出兩種不同的1-sst基因(sst-Ⅰ和sst-Ⅱ)在CAMV-35S啟動(dòng)子控制下得到表達(dá)。為了研究引入基因的效果，含有一個(gè)額外的1-sst基因的植物在類似條件下培育生長(zhǎng)。野生菊苣內(nèi)1-SST活性降低和通過1-FFT對(duì)蔗糖的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的作用通常發(fā)生在9～11月，對(duì)這段時(shí)期的菊糖mDP和1-SST、1-FFT、1-FEH的活性進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。比較控制植物與含有菊芋sst-Ⅱ基因的植物發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因?qū)?-SST總活性有著顯著的貢獻(xiàn)。在實(shí)驗(yàn)第8周，這種額外的1-SST活性導(dǎo)致mDP上升20%。但是，含有sst-Ⅰ基因的植物并沒有呈現(xiàn)出較高水平的1-SST活性，也沒有表現(xiàn)出mDP的顯著改變。然而低溫下，這兩種類型的轉(zhuǎn)基因植物(含有sst-Ⅰ或sst-Ⅱ)和野生植物產(chǎn)生相似的mDP降低的影響，在生長(zhǎng)季節(jié)結(jié)束時(shí)未生成較長(zhǎng)鏈的果聚糖，最有可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)低溫下FEH的誘導(dǎo)。(2)降低1-FEH活性以提高菊苣菊糖在收獲時(shí)的mDP。如將組成型CAMV-35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的FEH-Ⅰ反義片段插入菊苣基因組中。但是在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因冷處理特別是誘導(dǎo)FEH-Ⅰ時(shí)，對(duì)mDP只有輕微的影響，可能的解釋是，剩下的feh-Ⅰ導(dǎo)致足夠的1-FEH活性來降低mDP。

2.2為改變果聚糖類型，菊苣中果聚糖生物合成的修改

Sprenger等將大麥中蔗糖:果聚糖-6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Sucrose:fructan 6-fructosyltransferase,6-SFT)引入到菊苣中，以生產(chǎn)混合型果聚糖，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物主根中的菊糖組合物并沒有改變。然而，放置在蔗糖溶液中的菊苣葉切片在光照下連續(xù)積累β(2-1)菊糖和β(2-6)果聚糖證明了菊苣中大麥6-SFT的功能性；延長(zhǎng)光照后，轉(zhuǎn)基因葉片中的大多數(shù)果聚糖是菊糖型，只有一小部分含有混合型果聚糖。原因可能是1-FFT對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)勝過異源6-SFT。這種對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)也可能是主根中混合型果聚糖存在的原因，并可能由于6-sft比內(nèi)源性1-fft有較低的表達(dá)或是1-FFT對(duì)底物有較高的親和力。另外，Vijn等[12]將洋蔥編碼基因6G-FFT引入到菊苣中?？傊?，為了提高mDP或改變果聚糖類型，修改菊苣中菊糖代謝的嘗試方法包括額外基因的轉(zhuǎn)入和外水解酶基因的抑制。雖然轉(zhuǎn)入基因具有功能性并且在轉(zhuǎn)基因植物中可檢測(cè)到基因抑制，但在mDP和菊糖組成上只有很少的預(yù)期效果。強(qiáng)啟動(dòng)子可以用于驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)，例如菊苣中的1-fft啟動(dòng)子；為了阻止外水解酶的活性，3個(gè)feh基因(feh-Ⅰa、feh-b、feh-Ⅱ)可能需要被抑制，最好使用更有效的基因沉默技術(shù)，如RNA干擾(RNAi)、敲除突變體等。

2.3 其它植物中果聚糖生物合成的修改

枯草芽孢桿菌的sacB基因在黑麥草中表達(dá)的研究表明，果聚糖在植物中的積累干擾了果聚糖的天然結(jié)構(gòu)。天然的高聚合度果聚糖被耗盡，而較低聚合度果聚糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[13]。將從大麥中提取到的6-gff或1-sst在黑麥草中表達(dá)，得到了比野生型植株中多15%的果聚糖，表明在不損害植物生長(zhǎng)的情況下增加了果聚糖含量[14]。Sobobel等[15]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌天冬酰胺合成酶在轉(zhuǎn)基因萵苣中過度表達(dá)累積的果聚糖是野生植物累積的30倍。

上述研究顯示，天然果聚糖的組成可以在轉(zhuǎn)基因植物中被顯著改變，對(duì)果聚糖產(chǎn)量和組成的影響比早期的轉(zhuǎn)基因菊苣更為明顯。

3 特定果聚糖的合成

特定果聚糖，即具有所需鏈長(zhǎng)度和連接型的果聚糖，主要依賴于適當(dāng)基因的選擇。Koops等[11]采用轉(zhuǎn)基因甜菜作為特定果聚糖的事例證明1-sst基因和1-fft基因的不同組合產(chǎn)生具有不同菊糖類型的甜菜轉(zhuǎn)化體。將洋蔥的1-sst和6-gff成功轉(zhuǎn)入甜菜中也可獲得特定分支的果聚糖[16]。除了用于生物合成的基因源，可用的底物和與其它碳水化合物的生物合成途徑的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)果聚糖的積累也是很重要的。

3.1 蔗糖的可用性決定了果聚糖產(chǎn)量

宿主作物是非常重要的產(chǎn)率影響因素。馬鈴薯與甜菜相比都具有相同的菊芋1-sst基因，但產(chǎn)量差距很大，相比馬鈴薯，甜菜積累了50倍以上的菊糖[17，18]。同樣，相比淀粉積累品種，淀粉缺乏的玉米可以累積60倍的菊糖而得到更高產(chǎn)率?；谔鸩撕偷矸廴狈τ衩锥伎梢苑e累較高產(chǎn)率的蔗糖，可以得出結(jié)論，蔗糖可用性是這些轉(zhuǎn)基因植物中果聚糖產(chǎn)量的決定性因素。

3.2 果聚糖積累與淀粉的競(jìng)爭(zhēng)

許多果聚糖積累的平臺(tái)植物也可生產(chǎn)淀粉，碳水化合物的合成途徑與果聚糖的生物合成使用相同的底物，可能具有競(jìng)爭(zhēng)性。對(duì)存儲(chǔ)蔗糖的轉(zhuǎn)基因淀粉缺乏玉米的果聚糖積累量和轉(zhuǎn)基因淀粉積累玉米的果聚糖積累量進(jìn)行比較時(shí)，相同的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因得以表達(dá)，轉(zhuǎn)基因淀粉缺乏玉米積累的果聚糖為20 mg·gFW-1，轉(zhuǎn)基因淀粉積累玉米產(chǎn)量較前者少60倍[17]。在馬鈴薯作為宿主生產(chǎn)果聚糖的研究中，Caimi等[19]報(bào)道了減少淀粉量的情況，說明了種子質(zhì)量的大幅減少和淀粉含量的減少，主要是由于蔗糖合成酶和蔗糖SacB蛋白質(zhì)之間的競(jìng)爭(zhēng)。從這些研究中可以得出結(jié)論,淀粉積累作物生產(chǎn)果聚糖時(shí)，淀粉生產(chǎn)和果聚糖的生物合成對(duì)蔗糖的競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)影響兩者或其中之一的存儲(chǔ)碳水化合物的合成，也不利于在平臺(tái)作物上生產(chǎn)果聚糖。

3.3 生產(chǎn)特定果聚糖的平臺(tái)作物

優(yōu)良的適合果聚糖生產(chǎn)的平臺(tái)作物是高產(chǎn)率、擁有大存儲(chǔ)器官積累蔗糖并只有很少或根本沒有淀粉產(chǎn)生的植物，并且具有可用的原料提取處理鏈。甜菜能夠積累高濃度的蔗糖(200 mg·gKW-1)，產(chǎn)率為10～14 t·hm-2，生產(chǎn)提取過程可參照菊苣菊糖，是一種成功的果聚糖生產(chǎn)平臺(tái)作物[11,16,18]。另一種潛在的強(qiáng)大平臺(tái)作物是甘蔗，具有較高的蔗糖含量(成熟莖節(jié)500 mg·gDW-1[20])和完善的畜牧業(yè)加工鏈，產(chǎn)率(6～14 t·hm-2)與甜菜相近。Nicholson[21]成功地在甘蔗中引進(jìn)了朝鮮薊的1-SST，可在相似條件下生產(chǎn)1-蔗果三糖，但產(chǎn)量(112 nmol·gFW-1)較轉(zhuǎn)基因甜菜低1000倍。水稻也被證明能夠表達(dá)1-sst和6-sft基因，表達(dá)1-sst的轉(zhuǎn)基因水稻在葉片中能累積達(dá)16 mg·gFW-1的果聚糖[22]。雖然相比之下轉(zhuǎn)基因水稻的果聚糖濃度較低，但是可以在原本無用的水稻葉中生產(chǎn)果聚糖，提高了利用價(jià)值。綜上所述，果聚糖生產(chǎn)最具潛力的平臺(tái)作物是甜菜和甘蔗，其次是水稻。

4 結(jié)語

多種細(xì)菌和植物果糖基轉(zhuǎn)移酶基因已被轉(zhuǎn)入許多不同的植物中，如單子葉植物(水稻、玉米、甘蔗等)、雙子葉植物(馬鈴薯、甜菜等)。果聚糖合成的修改或基因轉(zhuǎn)入效果主要參照果聚糖的產(chǎn)率、聚合物的長(zhǎng)度和果聚糖連接型的改變。新平臺(tái)作物相比菊苣的生產(chǎn)水平(11 t菊糖·hm-2)可能還不具備競(jìng)爭(zhēng)性，然而它們具有一定的優(yōu)點(diǎn)，為特定果聚糖的生產(chǎn)提供了良好的起點(diǎn)。甜菜、甘蔗和水稻是最具潛力的生產(chǎn)平臺(tái)作物。迄今為止，多種基因已從不同物種中分離用于生產(chǎn)特定果聚糖?？傊?，在平臺(tái)作物中合成特定果聚糖的許多可能性是存在的，而且有些已被證實(shí)。

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RecentAdvancesofTailor-MadeFructanSynthesisinPlants

DAI Xiao-li

(CollegeofChemicalEngineering,QingdaoUniversityofScienceandTechnology,Qingdao266042,China)

Fructan,a fructose polymer,is produced by many bacteria and plants and used as carbohydrate reserve.Chicory is a commercial fructan producing crop.Studies using genetically modification showed that fructan biosynthesis is difficult to steer in chicory.Alternatives for production of tailor-made fructan,fructan with a desired polymer length and linkage type,are originally nonfructanaccumulating plants expressing introduced fructosyltransferase genes.Fructan biosynthesis and its modification,synthesis of tailor-made fructan,and function and utilization of fructan were briefly reviewed in the article.

fructan;plant;chicory;fructosyltransferase;genetic modification

Q 943.2

A

1672-5425(2013)12-0014-04