節(jié)裂角茴香幾種溶劑提取物對(duì)粘蟲的作用方式研究

張君霞，楊曉華，楊順義，張新虎，沈慧敏＊

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

節(jié)裂角茴香（Hypecoumleptocarpum）系罌粟科（Papaveraceae）角茴香屬（Hypecoum）一年生植物，主要分布在我國西北地區(qū)，在甘肅省的大部分天然草地中都有分布，魏有海等［1］報(bào)道，免耕溝播油菜（Brassica campestris）田節(jié)裂角茴香為3級(jí)以上危害雜草，家畜誤食后常引起中毒。

罌粟科植物因?yàn)槔浰冢≒apaversomniferum）而聞名于世，從該科植物中篩選具有殺蟲活性的有毒物質(zhì)，用以開發(fā)植物源農(nóng)藥具有先天優(yōu)勢(shì)，但從目前文獻(xiàn)報(bào)道來看，殺蟲植物中研究較多的有楝科（Meliaceae）、豆科（Leguminosae）、瑞香科（Thymelaeaceae）、菊科（Compositae）等，相對(duì)罌粟科研究少之又少，僅見報(bào)道有小果博落回（Macleayamicrocarpa），如葉道年［2］報(bào)道了博落回有強(qiáng)大的殺蛆作用，將博落回莖葉放入糞坑4～5d，莖葉腐爛后就能把蠅蛆全部殺死；張勝菊等［3］的研究表明，博落回石油醚抽提物200倍液對(duì)黃守瓜（Aulacophorafemoralis）和菜青蟲均有較好的防效，尤其是防治活動(dòng)能力強(qiáng)的害蟲效果更好。石進(jìn)樣等［4］的試驗(yàn)表明，博落回的乙醇粗提物和水提物對(duì)菜蚜（Lipaphiserysimi）有很強(qiáng)的毒殺作用；王興林等［5］的研究表明小果博落回丙酮提取物對(duì)棉鈴蟲（Heliothisarmigera）生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的抑制作用。另外，罌粟科角茴香屬，目前主要以藏藥和化感作用研究為主［6－10］，如雷國蓮等［8］研究發(fā)現(xiàn)，角茴香全草含角茴香堿、角茴香酮、原阿片堿、直立角茴香堿；郭潔等［9］研究表明，角茴香正丁醇提取物對(duì)肝細(xì)胞水腫變性、胞漿疏松及壞死均有明顯保護(hù)作用，還通過小鼠熱板試驗(yàn)可知，其具有一定的鎮(zhèn)痛作用；李普衍［10］研究表明，角茴香水煎劑對(duì)人型結(jié)核桿菌及枯草桿菌有抑制作用，其乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、白喉?xiàng)U菌、枯草桿菌、霍亂弧菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌及常見致病菌均有較強(qiáng)的抑制作用，其氯仿提取物發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用；王俊儒等［11］研究發(fā)現(xiàn)，角茴香水浸液含有化感物質(zhì)，可引起生菜（Lactucasativa）幼苗體內(nèi)過量活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而造成了其生長(zhǎng)弱小，競(jìng)爭(zhēng)力削弱。

本項(xiàng)目組成員在對(duì)天祝草地有毒殺蟲植物進(jìn)行篩選過程中，發(fā)現(xiàn)了節(jié)裂角茴香具有殺蟲活性［12－13］，但有關(guān)其殺蟲作用方式還未見報(bào)道［14－20］。因此，本研究以采自甘肅省天?？h抓喜秀龍?zhí)烊徊輬?chǎng)的節(jié)裂角茴香為材料，采用2種方法，4種溶劑提取，獲得了8種提取物，對(duì)粘蟲進(jìn)行了生物活性測(cè)定，以明確節(jié)裂角茴香對(duì)粘蟲的作用方式，為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物 節(jié)裂角茴香于2008年5月下旬，采集于甘肅天祝抓喜秀龍?zhí)烊徊莸亍?/p>

1.1.2 供試?yán)ハx 粘蟲（Mythimnaseperata）由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥系實(shí)驗(yàn)室提供。飼養(yǎng)條件：（25±1）℃，濕度（80±7）%，光照12h。用玉米葉人工飼養(yǎng)，選擇大小一致的3齡幼蟲供試。

1.1.3 試劑 乙醇、甲醇、正己烷、二氯甲烷，均為分析純。

1.2 植物提取物的制備

將采回的節(jié)裂角茴香植物洗凈，置于通風(fēng)處陰干，一部分植物樣品陰干后從根莖基部5cm處剪開，分為地上部分和地下部分，分別粉碎后過40目篩（孔徑0.37mm），密封并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 恒溫振蕩法 2011年4月，取經(jīng)粉碎植物樣品4份，每份25g于具塞三角瓶中，分別加入100mL四種溶劑，密封后于30℃恒溫振蕩器每隔2h振蕩2h，共振蕩12h。經(jīng)布氏漏斗減壓抽提后繼續(xù)倒入100mL相同溶劑，采用相同方法振蕩，重復(fù)3次。合并3次提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，定容至100mL，得到節(jié)裂角茴香的4種溶劑的提取物，最終提取物質(zhì)量濃度為1g/mL（即1mL提取物中含1g干物質(zhì)樣品），將4種溶劑提取液置于三角瓶中，密封后置于0～4℃的冰箱中保存?zhèn)溆茫?2－15］。

1.2.2 索氏抽提法 2011年4月，取節(jié)裂角茴香樣品4份，每份50g于濾紙筒中，分別用4種溶劑在索氏抽提器中提取36h，4種溶劑提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量后轉(zhuǎn)入刻度試管中，用溶劑定容為1g/mL，密封，于0～4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 植物提取物對(duì)粘蟲的作用方式測(cè)定方法

1.3.1 植物提取物對(duì)粘蟲的拒食作用測(cè)定方法 將玉米葉打成直徑為1.5cm的圓形葉碟，用移液槍點(diǎn)滴30 μL 8種植物提取物于葉碟，待溶劑揮發(fā)后放入保濕培養(yǎng)的培養(yǎng)皿，再接入饑餓3h的3齡幼蟲2頭，設(shè)相應(yīng)溶劑及清水為對(duì)照，每處理10頭試蟲，重復(fù)3次。隨時(shí)補(bǔ)充處理葉碟［8］。于處理24，48，72h后分別統(tǒng)計(jì)取食葉面積并計(jì)算拒食率［12－13］。

1.3.2 植物提取物對(duì)粘蟲的觸殺作用測(cè)定方法 用微量點(diǎn)滴器將1μL 8種植物提取物的藥液點(diǎn)滴于3齡粘蟲前胸背板處，以點(diǎn)滴等量相應(yīng)溶劑及清水為對(duì)照。每處理10頭粘蟲，重復(fù)3次。將處理過的粘蟲置于以濾紙保濕培養(yǎng)皿中，在恒溫培養(yǎng)箱（溫度24～26℃，濕度80%，光照12h）內(nèi)以新鮮玉米葉片飼喂，并于24，48，72h后清理并記錄各組的死亡率，計(jì)算校正死亡率［8－11，13］。

1.3.3 植物提取物對(duì)粘蟲的胃毒作用測(cè)定方法 參照慕立義［21］的改進(jìn)夾毒葉片法，在直徑為1.5cm的玉米葉碟上點(diǎn)滴30μL藥劑，以點(diǎn)滴等量相應(yīng)溶劑及清水為對(duì)照，待溶劑揮發(fā)后，將處理過玉米葉碟置于以濾紙保濕培養(yǎng)皿中，每皿接入2頭試蟲，每處理10頭粘蟲，重復(fù)3次。于處理后24，48，72h記錄各組的死亡率，計(jì)算校正死亡率。

1.3.4 植物提取物對(duì)粘蟲的生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用測(cè)定方法 參照胡美英［22］方法，將新鮮的玉米葉片浸入待測(cè)樣品中2～3s，以浸漬相應(yīng)溶劑及清水為對(duì)照，待藥劑揮發(fā)干后，放入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，然后接入已稱重的饑餓4h的粘蟲3齡幼蟲，每皿1頭，共處理10頭。處理前稱體重，處理后每隔24h稱1次體重，更換新鮮處理葉碟飼喂，48h后換新鮮無毒的葉片，繼續(xù)飼喂至化蛹，記錄死亡蟲數(shù)、蛹重和化蛹率，計(jì)算生長(zhǎng)發(fā)育抑制率［8－12，20］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用SPSS 17.0軟件Duncan法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲的拒食作用

8種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲3齡幼蟲的拒食作用測(cè)定結(jié)果見表1。8種提取物對(duì)粘蟲均有較高的拒食作用。索氏抽提法提取物對(duì)粘蟲的拒食活性略高于恒溫振蕩法，且2種方法的乙醇提取物對(duì)粘蟲拒食活性最高，處理48h后，拒食率分別為85.25%和90.78%，甲醇提取物分別為80.25%和84.67%，二氯甲烷提取物分別為79.05%和83.29%，僅次于甲醇提取物，正己烷最低，拒食率為73.25%和74.67%。

2.2 8種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲的觸殺作用

8種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲3齡幼蟲的觸殺作用測(cè)定結(jié)果見表2。8種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲的觸殺活性較弱，最高的是索氏提取法獲得的乙醇提取物，48h校正死亡率為33.33%；其他7種提取物的較正死亡率均在30%以下。

2.3 8種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲的胃毒作用

8種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲3齡幼蟲的胃毒作用測(cè)定結(jié)果見表3。8種節(jié)裂角茴香提取物24和48h對(duì)粘蟲的胃毒作用都不明顯，胃毒活性最強(qiáng)的是索氏抽提法的乙醇提取物，48h校正死亡率為23.3%。其次是甲醇和二氯甲烷提取物，48h校正死亡率均為16.7%。

表1 8種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲的拒食作用Table 1 Anti－feeding activities of 8 H.leptocarpumextracts against M.seperata

表2 8種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲的觸殺作用Table 2 Contacting activities of 8 H.leptocarpumextracts against M.seperata

表3 8種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲的胃毒作用Table 3 Stomach activities of 8 H.leptocarpumextracts against M.seperata

2.4 4種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲的生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用

通過以上3種作用方式的測(cè)定，可知索氏抽提法及乙醇是節(jié)裂角茴香殺粘蟲的最佳提取方法及溶劑。因此，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用的測(cè)定及節(jié)裂角茴香不同部位拒食作用測(cè)定分別選用了最佳提取方法及溶劑獲得的提取物。

對(duì)粘蟲3齡幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用測(cè)定結(jié)果見表4。節(jié)裂角茴香4種溶劑提取物對(duì)粘蟲3齡幼蟲均有一定的生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用，其中甲醇和乙醇的抑制率最高，24h后抑制率分別為91.45%和89.82%，48h后以乙醇的生長(zhǎng)發(fā)育抑制率最高，為87.00%。4種溶劑提取物的生長(zhǎng)發(fā)育抑制率均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，其中以正己烷的提取物最為明顯，乙醇提取物的生長(zhǎng)發(fā)育抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)降低幅度較小，生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用較穩(wěn)定。經(jīng)4種提取物處理后的粘蟲與對(duì)照比較均表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育延緩，以乙醇及甲醇提取物的帶藥葉碟飼喂48h后，化蛹率最低，均為23.33%。

表4 4種節(jié)裂角茴香提取物對(duì)粘蟲的生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用Table 4 Growth inhibiting effects of 4 H.leptocarpumextracts against M.seperata

2.5 節(jié)裂角茴香不同部位提取物對(duì)粘蟲3齡幼蟲的拒食作用比較

以乙醇為提取溶劑，將節(jié)裂角茴香地上部分和地下部分用索氏抽提法提取，測(cè)定了2種提取物對(duì)粘蟲3齡幼蟲的拒食活性，比較了植株不同部位對(duì)粘蟲的殺蟲作用，結(jié)果見表5。節(jié)裂角茴香的地上部分乙醇提取物對(duì)粘蟲的拒食活性明顯高于地下部分，24和48 h拒食率分別為90.43%和94.67%，而地下部分醇提取物的拒食率僅為50.33%和56.00%。可見節(jié)裂角茴香對(duì)粘蟲的拒食活性物質(zhì)主要集中在地上部分。

表5 節(jié)裂角茴香不同部位提取物對(duì)粘蟲3齡幼蟲的拒食作用比較Table 5 Anti－feeding effects of different part of H.leptocarpumextracts against M.seperata

3 結(jié)論與討論

節(jié)裂角茴香殺粘蟲活性物質(zhì)最佳提取方法為索氏抽提法，最佳提取溶劑為乙醇，其次是甲醇、二氯乙烷，正己烷提取效果最差。同科植物博落回的相關(guān)研究表明，博落回根乙醇提取物對(duì)菜粉蝶（Pierisrapae）、亞洲玉米螟（Ostriniafurnacalis）和桃蚜（Myzuspersicae）幼蟲具有很強(qiáng)的生物活性［23］；博落回植株乙醇提取物對(duì)菜粉蝶5齡幼蟲24和48h的非選擇性拒食率分別為91.52%和92.06%［24］；王高學(xué)等［25］通過對(duì)氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醇作為溶劑得到的提取物活性部位試驗(yàn)，確定具有殺蟲活性的部位為氯仿提取。馮崗［26］研究表明，在供試的5種不同溶劑提取物中，氯仿和乙醇提取物對(duì)粘蟲3齡幼蟲和小菜蛾3齡幼蟲的拒食活性最高，說明小果博落回的主要?dú)⑾x活性成分集中在氯仿和乙醇提取物。這與本文研究結(jié)果一致，由此可見：節(jié)裂角茴香殺蟲活性成分在加熱情況更易于提取、節(jié)裂角茴香殺蟲活性物質(zhì)集中在極性和弱極性部分，非極性物質(zhì)含量較少。

馮崗等［26－27］研究表明：小果博落回總生物堿對(duì)粘蟲、菜青蟲和小菜蛾主要表現(xiàn)為拒食和胃毒作用，而無明顯的觸殺和熏蒸作用，同時(shí)對(duì)粘蟲3齡幼蟲、菜青蟲5齡幼蟲、小菜蛾3齡幼蟲具有一定的生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用，對(duì)粘蟲還具有一定的殺卵作用；王亞維和尤民生［24］研究表明博落回植株乙醇提取物對(duì)菜粉蝶5齡幼蟲有很強(qiáng)的非選擇性拒食作用。這于本研究結(jié)果基本一致，即節(jié)裂角茴香提取物對(duì)3齡粘蟲的主要?dú)⑾x作用方式表現(xiàn)為：強(qiáng)烈的拒食作用及生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用，觸殺及胃毒作用較弱。分析其拒食及生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用原因可能是由于取食含毒葉片引起幼蟲的營(yíng)養(yǎng)條件變化、體內(nèi)代謝失調(diào)而使生長(zhǎng)發(fā)育受抑制，導(dǎo)致蛹重降低，化蛹率下降，化蛹時(shí)間延緩，出現(xiàn)半蛹半蟲現(xiàn)象，或在化蛹前期死亡。同時(shí)，從以上結(jié)果可以看出，節(jié)裂角茴香的地上部分的殺蟲活性明顯高于地下部分，表明節(jié)裂角茴香的殺蟲物質(zhì)主要集中在地上部位。另外，有關(guān)節(jié)裂角茴香拒食活性物質(zhì)的分離、純化和鑒定還有待進(jìn)一步研究。

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