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    基于數(shù)字編碼法的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)探究

    2013-04-08 05:09:42朱敏瑩宋志南
    上海醫(yī)藥 2013年21期
    關(guān)鍵詞:數(shù)字編碼雙歧生化

    朱敏瑩 宋志南

    (上海第一生化藥業(yè)有限公司 上海 200240)

    根據(jù)表型或者基因型,可將細(xì)菌鑒定方法分為兩大類,前者有雙歧索引法[1]、表解法[2]和數(shù)字編碼法等,它們經(jīng)過了多年的研究與歸納,逐步地發(fā)展、完善和創(chuàng)新,實現(xiàn)了自動化、商品化、標(biāo)準(zhǔn)化,在現(xiàn)階段是細(xì)菌鑒定的主流方法[3];后者有G + C % mol含量測定、16S rRNA測序法[4]等,隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,它將逐步成為主流方法。

    1 細(xì)菌鑒定的三大傳統(tǒng)方法

    1.1 雙歧索引法

    所謂雙歧,即二者取一、非此即彼。生化反應(yīng)的大部分都是定性反應(yīng),如革蘭染色反應(yīng)、觸酶試驗、氧化酶試驗等。雙歧索引法根據(jù)細(xì)菌的主要特性和次要特性,按照“非此即彼”的原則依次往下區(qū)分,直至將細(xì)菌準(zhǔn)確區(qū)分到最小鑒定單位,即屬或種的水平。

    這種方法的優(yōu)點是具有很強(qiáng)的邏輯推斷性,思維嚴(yán)謹(jǐn)、思路清晰,所導(dǎo)出的結(jié)果明確有力。缺點是每一步都建立在前次實驗的結(jié)果之上,鑒定過程費時費力,且早期誤差易被放大,從而導(dǎo)致完全錯誤的結(jié)果。

    1.2 表解法

    所謂表解,即是通過表格的形式,列出有一定關(guān)聯(lián)性的細(xì)菌進(jìn)行相同生化試驗的結(jié)果。《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》上有大量的生化反應(yīng)結(jié)果表格[5],都可以作為此法的判斷依據(jù)。

    表解法主要解決了雙歧索引法實驗過程冗長的問題。它的優(yōu)點是可以通過人的主觀推理以“走捷徑”的方式判斷出結(jié)果。缺點是可能會因主觀判斷的失誤而影響試驗選擇的客觀性,并導(dǎo)致不易察覺的錯誤結(jié)果。

    1.3 數(shù)字編碼法

    通過長時間的實驗積累,人們發(fā)現(xiàn)對某一種細(xì)菌的某一個生化反應(yīng)而言,其結(jié)果雖然是定性的,但卻不是完全不變的,即存在一定概率出現(xiàn)與大部分情況截然相反的結(jié)果[6]。在實際操作中往往由于這一點,使雙歧索引法和表解法存在不可避免的誤差。

    而數(shù)字編碼法正是建立在這種反應(yīng)不確定性的基礎(chǔ)上的。它以細(xì)菌的各種特性和反應(yīng)是同等重要的為理論基礎(chǔ),根據(jù)每種生化反應(yīng)在不同細(xì)菌中出現(xiàn)的概率進(jìn)行全面分析而得出結(jié)果[5]。作為一種傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法,它結(jié)合了雙歧索引法和表解法,并通過與數(shù)理統(tǒng)計學(xué)的學(xué)科交叉而產(chǎn)生。

    2 API系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)——數(shù)字編碼法

    2.1 數(shù)字編碼理論的建立

    在長時間的發(fā)展過程中,人們發(fā)現(xiàn)同一種而不同株的細(xì)菌,在同一個生化反應(yīng)下,結(jié)果會發(fā)生變化。這個現(xiàn)象一直干擾著細(xì)菌鑒定的精確度和準(zhǔn)確性。

    為了解決這一問題,1962年Beers等[7]提出用概率值來表示某生化試驗在指定細(xì)菌分類群中的陽性率。這是第一次將數(shù)理統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用于細(xì)菌鑒定學(xué)中。1968年Dybowski等[6]用條件概率法對肝腸菌科細(xì)菌進(jìn)行鑒定,首次提出了相對相似百分比PRL(Percentage Relative Likelihood)和模式分?jǐn)?shù)MLF(Modal Likelihood Fraction)這兩個數(shù)值鑒定參數(shù),這為后續(xù)的探索鋪平了道路。1970年Lapage等[8]用概率法對279株革蘭陰性桿菌進(jìn)行鑒定,鑒定正確率達(dá)到了70%以上,從此基于概率論的細(xì)菌鑒定法受到了重視。1973年Lapage[9]繼續(xù)深入地探索了這一方法,并且建立了科學(xué)的細(xì)菌數(shù)字編碼鑒定的數(shù)理模型,數(shù)字編碼法正式得到認(rèn)可。在這之后,法國梅里埃公司在Lapage的理論基礎(chǔ)上提出了參數(shù)T值,并建立了可信度評價標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)一步完善了這一理論。

    2.2 數(shù)字編碼理論的解析

    2.2.1 鑒定系統(tǒng)的內(nèi)部計算方法

    細(xì)菌數(shù)字編碼鑒定法以Bayer理論和Lapage理論為基礎(chǔ),以細(xì)菌條目、鑒定試驗和概率這三大要素為數(shù)據(jù),經(jīng)過統(tǒng)計計算給出結(jié)果。

    在實踐中,學(xué)校將課程分為道德、人文、科學(xué)、健康、藝術(shù)五大學(xué)習(xí)領(lǐng)域,每一領(lǐng)域又包含基礎(chǔ)性、拓展性兩類課程。無論是基礎(chǔ)性課程,還是拓展性課程,都圍繞上面的五個領(lǐng)域落實并強(qiáng)化五種素養(yǎng)。為了提高學(xué)生的綜合素養(yǎng),學(xué)校還打破學(xué)科與學(xué)科之間、課內(nèi)與課外之間、校內(nèi)與校外之間的壁壘,突破傳統(tǒng)課程模式,自主開發(fā)了各類綜合性課程。目的是通過課程體系的建構(gòu)、課程方案的落實,實現(xiàn)“為學(xué)生的幸福人生奠基”的辦學(xué)理念。

    法國梅里埃公司的API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)是數(shù)字編碼法最典型的代表,也是現(xiàn)今使用最廣泛的一個鑒定系統(tǒng)。API系統(tǒng)在細(xì)菌鑒定方面有15個品種,分別具有相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。它將需要用到的生化反應(yīng)全部集成于一個PVC材質(zhì)的試劑條里,可以達(dá)到快速反應(yīng)讀取結(jié)果的目的。

    以API鑒定系統(tǒng)為例,作為對結(jié)果的評價依據(jù)所計算的參數(shù)有以下幾個。

    1) %ID值 即鑒定百分率。是每個細(xì)菌條目生化反應(yīng)的出現(xiàn)概率值與該細(xì)菌條目所在分類菌群中的所有細(xì)菌條目生化反應(yīng)出現(xiàn)概率值總和的比值。它表示的是每種細(xì)菌出現(xiàn)的可能性。以微球菌科為例,表1是截取自API V4.0 STAPH數(shù)據(jù)庫中的反應(yīng)鑒定表,表中的數(shù)字部分表示該細(xì)菌條目于該反應(yīng)的陽性反應(yīng)概率。

    表1 API V4.0 STAPH 反應(yīng)鑒定表a)(部分)[10]

    表中第二行以某一未知細(xì)菌的檢驗結(jié)果為例,其%ID值的計算步驟如下:

    (1)假設(shè)該細(xì)菌條目為金黃色葡萄球菌,計算各反應(yīng)的出現(xiàn)頻率。

    (2)如LAC為陽性,則該反應(yīng)的出現(xiàn)頻率FLAC=88/100。

    (3)如TRE為陰性,則該反應(yīng)的出現(xiàn)頻率FTRE=1–(80/100)。

    (4)若陽性反應(yīng)概率為0或100,則用近似值0.01和0.99代替。

    (5)計算每一個反應(yīng)的出現(xiàn)頻率。在一個細(xì)菌條目中,將該條目所有反應(yīng)的出現(xiàn)頻率相乘,得出此細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率(式1)。

    (6)按照上述方法,計算該分類菌群中所有細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率。

    (7)計算整個分類菌群的多項總發(fā)生頻率。將該分類菌群中所有細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率相加,得到多項總發(fā)生頻率(式2)。

    (8)計算某一細(xì)菌條目的%ID值。將某細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率除以多項總發(fā)生頻率,再乘以100,即得到該細(xì)菌條目的%ID值(式3)。

    2) T值 為某細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率除以該細(xì)菌條目最典型菌的總出現(xiàn)頻率得到的值(式4)。T值代表的是個體相較于最普遍情況的近似性。越接近1,表示鑒定結(jié)果的價值越大。

    3) R值 %ID按大小排序之后,相鄰兩項條目的%ID之比,代表兩種可能性之間的差距。R值越大,表明結(jié)果之間的差距越大,鑒定結(jié)果的價值也越大。

    2.2.2 API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)

    當(dāng)使用試劑條后,讀取反應(yīng)的結(jié)果,并輸入電腦,由梅里埃公司的ATBNew軟件計算得出此次結(jié)果的%ID值和T值。計算過程完成后,系統(tǒng)會根據(jù)%ID的大小,將結(jié)果降序排列,并對結(jié)果作出評價。具體評價方法如下。

    1) 排在第一位的細(xì)菌條目%ID≥80時,其評價方法如表2所示:

    表2 第一位細(xì)菌條目%ID≥80時的評價方法

    2) 排在第一位的細(xì)菌條目%ID<80時:

    排在前三位的細(xì)菌條目%ID之和≥80的,根據(jù)這些菌的歸類,如果是同一菌種下的不同菌株,則結(jié)果為鑒定到種水平。如果是同一屬下的不同菌種,則結(jié)果為鑒定到屬水平。鑒定的評價則為他們%ID之和,再依據(jù)上節(jié)所述作出。如果既不屬于同一種,也不屬于同一屬,則結(jié)果為低分辨率。

    如排在前三位的菌名%ID之和仍然<80,則結(jié)果為不可接受。

    2.3 數(shù)字編碼法的發(fā)展

    西方國家在20世紀(jì)70年代就開始此方面的研究,由于起步較早,他們的產(chǎn)品已經(jīng)具有很高的專業(yè)化、自動化、商品化、標(biāo)準(zhǔn)化的水平。其中具有代表性的有梅里埃 API系統(tǒng),Vitek 系統(tǒng)[11],Microscan Walkaway[12]和BD Phoenix[13]等。國內(nèi)在這方面的研究從20世紀(jì)90年代才開始,起步較晚,但也有不少具有代表性的產(chǎn)品,如杭州天和HW-138細(xì)菌鑒定分析儀[14]、山東鑫科XK-3401自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)[15]等,上海華山醫(yī)院也有自主研發(fā)的肝腸菌科細(xì)菌鑒定板條[16]。

    總體來看,進(jìn)口產(chǎn)品因為其準(zhǔn)確度高、配套設(shè)備成熟等原因,占據(jù)著主流市場,但又由于其技術(shù)壟斷,因此售價較高,使檢驗的成本居高不下。但隨著國內(nèi)技術(shù)的前進(jìn),兩者之間的差距會越來越小,因此可以期待有更物美價廉的產(chǎn)品出現(xiàn)。

    3 數(shù)字編碼法在實際應(yīng)用中需注意的問題

    根據(jù)上述細(xì)菌鑒定方法的原理,可以知道要通過傳統(tǒng)方法使鑒定結(jié)果完全可信是不可能的。根據(jù)式1、式2、式3可知,因為F細(xì)菌條目<F總,所以%ID<1,即鑒定結(jié)果的可信度始終不會是100%,即使是標(biāo)準(zhǔn)菌株,其%ID值也不會為1。因為這個方法建立在概率論與統(tǒng)計學(xué)的基礎(chǔ)上,支撐它的是前期大量數(shù)據(jù)的積累所形成的數(shù)據(jù)庫,但數(shù)據(jù)的積累都有局限性,而且其本身的算法也決定了%ID只可能接近1,而不可能等于1。

    在平時的檢驗過程中,即使排除了操作上的誤差,也仍將難以避免地遇到低分辨率或鑒定失敗的結(jié)果。因此,必須在實際應(yīng)用中理性地審視實驗結(jié)果,既不能因為鑒定結(jié)果的%ID值相對較低而否定結(jié)論,也不能因為%ID值相對較高而迷信結(jié)論。這是傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法無法回避的一個局限性,但這并不代表實驗的結(jié)果完全沒有價值,我們可以通過一些方法來改善這一問題。

    為了提高結(jié)論的準(zhǔn)確度和可信性,我們大致可以采用以下兩種方法。其一是復(fù)核試驗法,根據(jù)鑒定結(jié)果選擇一個或幾個生化反應(yīng)進(jìn)行復(fù)試(我們一般依照表解法的思路來進(jìn)行選擇),再根據(jù)復(fù)試結(jié)果來評價鑒定結(jié)果。其二是平行試驗法,即采用兩種方法或兩個系統(tǒng)進(jìn)行平行試驗、比對結(jié)果,例如同時使用API系統(tǒng)和16S rRNA序列分析法。

    4 各鑒定方法的優(yōu)缺點比較

    雙歧索引法和表解法作為最傳統(tǒng)的方法其優(yōu)點是硬件條件要求低,缺點是準(zhǔn)確度不高,檢驗時間長、效率低,難以商品化、自動化。

    數(shù)字編碼法的優(yōu)點是實驗簡單、快速,初期投入成本較低,上手難度低,準(zhǔn)確度較高,缺點是只能鑒定到種,實驗精度不夠,耗材成本較高。

    16S rRNA序列分析法作為分子生物學(xué)細(xì)菌鑒定方法的代表,其優(yōu)點是準(zhǔn)確率和可信度高,實驗周期短、精度高,可以進(jìn)行同源性分析,缺點是相關(guān)的儀器較昂貴,對實驗人員素質(zhì)要求較高。但隨著技術(shù)的完善,這一類方法在當(dāng)下已漸漸普及,也將成為今后的主流。

    5 結(jié)語

    隨著質(zhì)量技術(shù)系統(tǒng)的不斷發(fā)展,細(xì)菌鑒定必將成為一個常規(guī)檢驗項目,在選擇和建立檢驗方法時要對各現(xiàn)有方法進(jìn)行充分的比較。我們經(jīng)過實踐和總結(jié),認(rèn)為在初期應(yīng)選用以數(shù)字編碼法為基礎(chǔ)的檢驗方法,既能達(dá)到準(zhǔn)確快速檢驗的目的,也能兼顧成本、提高人員素質(zhì)。

    但在使用API等方便快捷的細(xì)菌鑒定試劑條產(chǎn)品時也會出現(xiàn)一些問題,如輕視傳統(tǒng)的基礎(chǔ)實驗、對成熟的、商品化的產(chǎn)品過分信任和依賴等。這些問題會表現(xiàn)在如僅通過%ID和T值就斷定結(jié)果而忽視補充實驗[17]、出現(xiàn)不可接受的結(jié)果時不從劃線分離等最基本的步驟開始找原因。因此在使用這類快速鑒定產(chǎn)品時仍應(yīng)保持客觀性,尤其在確定建立方法的初期,更應(yīng)熟悉所用方法的原理和內(nèi)涵,熟練基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗的操作。即便是基因水平的新方法,也離不開最基本的微生物實驗操作,而對基本操作的忽視,會成為實踐中最大的潛在問題。

    此外,應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到傳統(tǒng)方法本身的局限性,基于分子生物學(xué)的方法在將來成為主流是大勢所趨。建議在積累了一定數(shù)據(jù)和經(jīng)驗之后,可以逐步嘗試16S rRNA測序法。

    總之,對于普通企業(yè)而言,應(yīng)當(dāng)從簡到難、逐步深入、夯實基礎(chǔ),不能跨越式地追求最新的方法。

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