實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用

韓 齊，孔保華 ，李沛軍，李暮春

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

2011 年12 月21 日起，我國(guó)正式施行由衛(wèi)生部組織制定的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《速凍米面制品》(GB19295-2011)。新國(guó)標(biāo)中放寬了對(duì)金黃色葡萄球菌的要求，其含量由不得檢出調(diào)整到可限量檢出并采用三級(jí)采樣法，每一批生制品抽查的5 個(gè)樣品中允許有1 個(gè)樣品含金黃色葡萄球菌量在1000 ～10000cfu/g 內(nèi)，這批產(chǎn)品即為合格產(chǎn)品［1］。新國(guó)標(biāo)的頒布引發(fā)了激烈的爭(zhēng)論，金黃色葡萄球菌作為主要的食源性致病菌更是受到了廣泛的關(guān)注。金黃色葡萄球菌不僅存在于速凍米面制品中，乳、乳制品和肉類等也通常含有金黃色葡萄球菌的腸毒性菌株［2］。金黃色葡萄球菌的檢測(cè)通常采用以形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法［3］。目前，國(guó)標(biāo)方法［4］(GB4789.10-2010)主要采取Baird-Parker 平板和血平板相結(jié)合的傳統(tǒng)方法對(duì)食品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)。這些方法雖然操作簡(jiǎn)單，但耗時(shí)長(zhǎng)(需5d左右)、靈敏性差，會(huì)造成食品積壓過(guò)程中的經(jīng)濟(jì)損失。因此，需要一種靈敏、高效的方法對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速檢測(cè)。近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(簡(jiǎn)稱Real-time PCR)技術(shù)因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速和應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，已經(jīng)成功應(yīng)用于食品微生物學(xué)中并且能夠替代傳統(tǒng)培養(yǎng)方法來(lái)快速定量檢測(cè)樣本［5］。本文介紹了Real-time PCR 技術(shù)原理、分類和特點(diǎn)，并對(duì)Real-time PCR 技術(shù)在食品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)的研究進(jìn)展與應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 Real-time PCR 技術(shù)概述

過(guò)去20 年中，獨(dú)立于培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)有很大的發(fā)展。使微生物群落整體的分析變得可行，增加了我們對(duì)其成分、動(dòng)力學(xué)和活性的了解［6］。PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是誕生于1985 年的一項(xiàng)體外擴(kuò)增DNA 的技術(shù)［7］。定量PCR 已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù)，即實(shí)時(shí)熒光定量PCR(簡(jiǎn)稱Real- time PCR)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (Realtime Flurescent Quantitive Polymerase Chain Reaction)技術(shù)，由美國(guó)Applied Biosystems 公司于1996 年推出，可應(yīng)用于食源性致病菌的特異性和定量檢測(cè)，主要應(yīng)用于肉、肉類產(chǎn)品、乳和乳制品中。

1.1 Real-time PCR 技術(shù)原理

Real-time PCR 技術(shù)原理是將熒光基團(tuán)加入到PCR 反應(yīng)體系中，利用PCR 指數(shù)擴(kuò)增期間熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，并由此分析目的基因的初始量。Ct 值是Real-time PCR 技術(shù)中很重要的一個(gè)概念。C 指Cycle 即循環(huán)數(shù)，t 指threshold 即閾值，Ct 值表示的是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)［8］。研究表明［6，9］，每個(gè)模板的Ct 值與起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)之間存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。將已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為Ct 值。因此，只要知道未知樣品的Ct值，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出未知樣品的起始拷貝數(shù)，從而達(dá)到定量分析的目的。

1.2 Real-time PCR 技術(shù)分類及其特點(diǎn)

Real-time PCR 技術(shù)根據(jù)檢測(cè)的熒光信號(hào)可以分為兩類［10］:一類是雙鏈DNA 特異熒光染料(如SYBR GreenⅠ);另一類是特異性熒光標(biāo)記探針，包括水解探針(如TaqMan 或TaqMan-MGB)和雜交探針(如分子信標(biāo))。染料法是利用染料與雙鏈DNA 小溝結(jié)合發(fā)出的熒光信號(hào)指示增加的擴(kuò)增產(chǎn)物;探針?lè)▌t是利用能與靶序列特異性雜交的探針來(lái)指示增加的擴(kuò)增產(chǎn)物［11］。這些方法允許不需要PCR 后處理操作的自動(dòng)檢測(cè)，降低了相互污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，與常規(guī)PCR 相比，Real-time PCR 技術(shù)不僅完成了PCR從定性到定量的飛躍，其主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏性高、特異性強(qiáng)、降低擴(kuò)增規(guī)模并且不需要PCR 后處理操作，降低了相互污染的風(fēng)險(xiǎn)［12］。

熒光標(biāo)記探針?lè)椒ǎ绯Ｓ玫腡aqMan 探針?lè)?，?duì)PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)特異性更高［13］。但是需要根據(jù)非常嚴(yán)格的條件選擇適宜的引物和探針，這往往不易達(dá)到。而熒光染料法，如常用的SYBR Green I 染料法檢測(cè)PCR 產(chǎn)物則打破了這種限制，不需要連接熒光分子的探針［14］。兩種方法各有利弊，染料類方法的優(yōu)點(diǎn)是:靈敏度高;通用性好、不需要設(shè)計(jì)探針、方法簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉;可以高通量大規(guī)模的定量PCR 檢測(cè)。但是只適用于專一性要求不高的定量PCR 檢測(cè)。而探針類方法適用于擴(kuò)增序列專一的體系檢測(cè)，對(duì)特異性要求較高的定量。優(yōu)點(diǎn)是:高適應(yīng)性和可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)，但當(dāng)靶基因的特異性序列較短時(shí)，無(wú)論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計(jì)條件都不能解決。

近年來(lái)，快速核酸擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)迅速取代了傳統(tǒng)方法，實(shí)際上PCR 應(yīng)用于食品中病原體的檢測(cè)正日益增加。而且，Real-time PCR 提供一個(gè)靈活的檢測(cè)系統(tǒng)，在普通條件下也能立即檢測(cè)多種病原體［10］。許多Real-time PCR 方法經(jīng)發(fā)展研究已經(jīng)可以專門定性和定量檢測(cè)食源性致病菌，如金黃色葡萄球菌、沙門菌屬、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀菌屬和彎曲桿菌屬。Real-time PCR 技術(shù)直接定量檢測(cè)食品中細(xì)菌性病原體的應(yīng)用需要考慮以下方面［9］:選擇準(zhǔn)確并靈敏的Real-time PCR 方法;選擇高效的DNA 分離法;了解所選用方法與傳統(tǒng)細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法性能之間的差異。

2 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的特性

金黃色葡萄球菌于1884 年被首次發(fā)現(xiàn)［15］，是已知可導(dǎo)致食源性中毒的、菌落為球形的革蘭氏陽(yáng)性菌［16］。由于能夠產(chǎn)生外毒素和其他致病因素，使其成為全球性的致病菌之一。金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生多種毒素，主要為腸毒素(Staphylococcal Enterotoxins，SEs)、剝脫毒素(Exfoliative Toxin，ETs)和中毒休克毒素(Toxicshock Syndrome Toxin，TSST-1)等。金黃色葡萄球菌引起食物中毒主要原因是腸毒素(SEs)，它是一類毒力相似、結(jié)構(gòu)相關(guān)、抗原性不同的胞外蛋白質(zhì)［17］。SEs 是指在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(猴子)中口服投藥后引起嘔吐的葡萄球菌屬超抗原，而其它相關(guān)毒素類則為腸毒素類似(SEI)蛋白質(zhì)。目前，根據(jù)在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的催吐效果，已有18 類SEs 或SEI被報(bào)道［18］。根據(jù)血清抗原特異性不同，可將腸毒素分為A、B、C1、C2、C3、D、E 和F 共8 個(gè)型。其中，A 型毒素毒力最強(qiáng)，攝入1μg 即能引起中毒，故A 型腸毒素引起的食物中毒最常見(jiàn)。D 型毒力較弱，攝入25μg 才能引起中毒［19］。

金黃色葡萄球菌食物中毒(SEP)是指攝入含有一種或多種SEs 食物導(dǎo)致的中毒。當(dāng)金黃色葡萄球菌數(shù)量上升到105～106cfu/g 時(shí)［20］，就會(huì)引起食物中毒。金黃色葡萄球菌食物中毒的一般癥狀是突然發(fā)生惡心、劇烈的嘔吐、腹部絞痛和腹瀉，發(fā)病時(shí)間為食用了污染的食品后2～8h 內(nèi)［21］。其引起的食物中毒呈季節(jié)性分布，多見(jiàn)于春夏季;常存在于乳［22］、肉制品［23］及水產(chǎn)品中;此外，剩飯、涼菜及即食食品［16］中也經(jīng)常被檢測(cè)出含有金黃色葡萄球菌。

3 Real-time PCR 技術(shù)檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的進(jìn)展

金黃色葡萄球菌的檢測(cè)是日常食品監(jiān)測(cè)項(xiàng)目和食物中毒調(diào)查的重要的標(biāo)準(zhǔn)。目前已經(jīng)立法限量乳及乳制品、肉制品、雞蛋制品、冰淇淋和嬰兒食品等食品中的金黃色葡萄球菌含量，只允許含有極少量或不含有金黃色葡萄球菌。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用Real-time PCR 技術(shù)檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌的研究日益增加，使得Real-time PCR 技術(shù)得到逐步的完善。

3.1 原料乳及乳制品中的應(yīng)用

3.1.1 原料乳中金黃色葡萄球菌的檢測(cè) 金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致奶牛和其它反芻動(dòng)物乳腺炎的主要原因。乳腺炎導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量減少、動(dòng)物價(jià)值降低、丟棄牛奶等直接經(jīng)濟(jì)損失，還產(chǎn)生額外的獸醫(yī)和人工費(fèi)用［24］。而其產(chǎn)生的腸毒素A 是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。Fusco 等人［25］在使用Real-time PCR 方法快速定量檢測(cè)生牛奶中的金黃色葡萄球菌腸毒素基因組(egc)的研究中，同時(shí)采用TaqMan 探針和SYBR Green 染料兩種方法。這兩種方法對(duì)小組內(nèi)70 株參照菌株的特異性都接近100%，包括目前已知的所有29 株臨床和食源性金黃色葡萄球菌egc 變種菌株、4 株egc 陰性金黃色葡萄球菌菌株和37 株種族近似的相關(guān)菌株。應(yīng)用于實(shí)際牛奶樣品中時(shí)，與常規(guī)培養(yǎng)方法比較這兩種PCR 方法都提供了良好的響應(yīng)，100%的特異性診斷和96%～107%的相對(duì)精度。該方法由于其具有高特異性、動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍較廣和高靈敏度，即使是在混合和高潛在污染的生牛奶中，也可以快速高效的檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素基因組。

李一松等人［26］使用Real-time PCR 技術(shù)檢測(cè)乳中攜帶sea 基因金黃色葡萄球菌的研究中采用SYBR Green I 方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:該方法可以在8h 內(nèi)快速、穩(wěn)定地檢測(cè)出乳中的金黃色葡萄球菌，并確定了人為污染的牛乳中金黃色葡萄球菌的最低檢出限為83cfu/mL。Aprodu 等人［27］在分子定量檢測(cè)人為或自然污染牛奶中的金黃色葡萄球菌樣品前處理的研究中，討論了Real-time PCR 技術(shù)直接定量檢測(cè)食品樣品中病原體時(shí)，樣品處理對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響。研究中采用了3 種不同的樣品處理方法來(lái)確定牛奶中金黃色葡萄球菌的最低檢出限，分別為免疫磁性分離、基質(zhì)增溶和浮選法，并與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明，免疫磁性分離樣品制備雖然使用較方便、特異性較高和快速，但不能夠定量檢測(cè)低量和中量(＜104CFU)的金黃色葡萄球菌;基質(zhì)增溶和浮選法都允許在1～10 個(gè)細(xì)胞/mL 水平上定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌，這兩種方法都比平板接種檢測(cè)出更多的細(xì)菌細(xì)胞當(dāng)量(BCE)。因?yàn)槔碚撋希總€(gè)金黃色葡萄球菌細(xì)胞都可能促進(jìn)如腸毒素類等有害物質(zhì)的表達(dá)，所以在疫情評(píng)估中，使用一個(gè)準(zhǔn)確和標(biāo)準(zhǔn)化樣品處理的Real-time PCR 方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)基平板接種方法更接近實(shí)際情況。

3.1.2 乳制品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè) Real-time PCR 技術(shù)不僅可以應(yīng)用于乳中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，對(duì)以乳為原料的相關(guān)制品(如冰淇淋、干酪和乳粉)等也有很好的檢測(cè)效果。Hein 等人［28］在使用Real-time PCR 技術(shù)檢測(cè)干酪中金黃色葡萄球菌細(xì)胞的研究中，使用兩種Real-time PCR 方法通過(guò)檢測(cè)靶基因耐熱核酸酶(nuc)以定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌細(xì)胞。結(jié)果表明TaqMan 探針?lè)ū?6nuc 基因拷貝數(shù)/μL)比SYBR Green I 染料法(60 nuc 基因拷貝數(shù)/μL)靈敏度更高。在定量檢測(cè)人為污染干酪中金黃色葡萄球菌的應(yīng)用中，得到的靈敏度為1.5 ×102～6.4 ×102nuc 基因拷貝數(shù)/2g。細(xì)菌數(shù)(cfu)的對(duì)數(shù)與nuc 基因拷貝數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)為0.979～0.998，相關(guān)性良好。因此Real-time PCR 技術(shù)可以有效地檢測(cè)干酪中污染的金黃色葡萄球菌。

3.2 肉及肉類制品中的應(yīng)用

肉和肉類產(chǎn)品被認(rèn)為是金黃色葡萄球菌傳染的主要傳播媒介之一。因此，曾多次爆發(fā)由于肉類制品被金黃色葡萄球菌污染而引起的食物中毒［29］。徐德順等人［30］利用Real-time PCR 技術(shù)，建立食品中金黃色葡萄球菌污染的快速敏感特異的檢測(cè)方法。以市售生豬肉、雞肉等材料為原料經(jīng)金黃色葡萄球菌增菌液增菌培養(yǎng)后，分別使用TaqMan 探針?lè)ê蛡鹘y(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在10 株相關(guān)菌株的檢測(cè)中，除金黃色葡萄球菌表現(xiàn)很好的陽(yáng)性，其余菌株均為陰性。純菌條件時(shí)，最低檢測(cè)限為44cfu/mL。同一樣品重復(fù)3 次的Ct 值的變異系數(shù)均小于5%。因此Real-time PCR 技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便快捷、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，符合食品中病源微生物檢驗(yàn)的發(fā)展需要，值得推廣和應(yīng)用。Alarcón 等人［31］研究發(fā)現(xiàn)，在人為污染的牛肉樣品中使用兩種Real-time PCR 方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的最低限量為5 × 102cfu/2g，并且SYBR Green I 染料法和TaqMan 探針?lè)ň岣吡藱z測(cè)的靈敏度，分別將檢測(cè)水平降低到10 和100 個(gè)細(xì)胞水平。結(jié)果表明SYBR-Green I 染料方法成本更低，能夠靈敏、自動(dòng)定量檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌。

3.3 其它食品中的應(yīng)用

金黃色葡萄球菌是一種以群落普遍存在的病原體并且長(zhǎng)期被認(rèn)為是影響公共衛(wèi)生的一個(gè)主要問(wèn)題。在使用Real-time PCR 技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌時(shí)，經(jīng)常與多重PCR 結(jié)合使用，同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)菌性病原體，效果更好。

3.3.1 蔬菜中的應(yīng)用 Elizaquíve 等人［10］使用一種新的多重單管Real-time PCR 方法同時(shí)檢測(cè)新鮮的、最小程度處理的蔬菜中的大腸桿菌O157∶H7、沙門菌屬和金黃色葡萄球菌，三種被頻繁調(diào)查的食物傳播細(xì)菌性病原體。研究包括特異性檢驗(yàn)，并為沙門菌屬設(shè)計(jì)一種新的引物和探針。研究中同時(shí)采用SYBR Green I 染料法和TaqMan 探針?lè)?，將反?yīng)條件調(diào)整到可以同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)β-葡萄糖苷酸酶(uidA，E.coli)基因、耐熱核酸酶(nuc，Sta.aureus)基因和復(fù)制起始區(qū)(oriC，Salmonella spp.)的特異性片段。結(jié)果表明，這三種病原體的檢測(cè)靈敏度為103cfu/g。因此，多重Real-time PCR 技術(shù)的開(kāi)發(fā)使PCR 在食品檢測(cè)中的靈敏度得到了公認(rèn)，并且可以高流通量和自動(dòng)化檢測(cè)，有望作為食品行業(yè)快速和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。

3.3.2 豆制品中的應(yīng)用 姚蕾［32］等人在傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中三種致病菌檢測(cè)的研究中，以hly A 基因(單增李斯特菌)、Cereolysin AB 基因(蠟樣芽孢桿菌)和nuc 基因(金黃色葡萄球菌)為靶基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan 探針，優(yōu)化PCR 反應(yīng)體系，建立同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌等三種致病菌的三重Real-time PCR體系，并且進(jìn)行了特異性和敏感性實(shí)驗(yàn)。26 株非目標(biāo)菌的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，定量檢測(cè)批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于2%。單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的最低檢測(cè)限分別為3 ×103、2 ×104、2 ×104cfu/mL。表明該方法特異性強(qiáng)、靈敏度度高、重復(fù)性好，可以在8h 內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌等3 種致病菌進(jìn)行同步檢測(cè)。

3.4 食品加工表面金黃色葡萄球菌的檢測(cè)

歐洲已經(jīng)立法要求食品加工表面應(yīng)該是“健康衛(wèi)生并易于清洗”，食品加工表面不適當(dāng)?shù)那逑春拖敬嬖谥鴿撛诘氖称方徊娓腥撅L(fēng)險(xiǎn)。有研究表明［33］金黃色葡萄球菌等致病菌可以在手、海綿和炊具上存在幾小時(shí)甚至幾天。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法雖然使用簡(jiǎn)單，但僅限于潛伏期的24～48h，鑒于可能更早的需要結(jié)果，理想的時(shí)間是食品進(jìn)入市場(chǎng)前。因此，需要一種快速、穩(wěn)定的檢測(cè)方法。Martinona 等人［34］使用Real- time PCR 方法與疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)試劑結(jié)合定量檢測(cè)污染的食品加工表面的活性金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的研究中采用SYBR Green 染料法定量檢測(cè)加工表面的病原體數(shù)量。研究發(fā)現(xiàn)該方法與平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果沒(méi)有顯著差異。Real-time PCR與PMA 結(jié)合方法可以用于快速檢測(cè)接觸過(guò)高污染食品的接觸表面或監(jiān)測(cè)食品加工表面的消毒效果。

4 Real-time PCR 技術(shù)的應(yīng)用前景

實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)能夠有效解決傳統(tǒng)PCR 中只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，并且在封閉的條件下進(jìn)行反應(yīng)和分析，無(wú)需電泳等PCR 后處理操作，能有效預(yù)防PCR 產(chǎn)物之間的相互污染。并且由于其操作簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、假陽(yáng)性低、可定量檢測(cè)、誤差小、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品中微生物的檢測(cè)。因此，在食源性致病菌的檢測(cè)中可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法，更加高效和快速。

Real-time PCR 技術(shù)也存在著不足，如需要設(shè)計(jì)適宜的引物和探針，否則會(huì)降低檢測(cè)的特異性和靈敏度;食品基質(zhì)成分會(huì)影響酶活性;技術(shù)設(shè)備要求高，熒光探針費(fèi)用較高。然而，這種分子診斷技術(shù)最主要的缺陷是不能區(qū)別活性和死亡病原微生物的DNA。但使用PMA 可以解決這個(gè)問(wèn)題。PMA 作為DNA 嵌入試劑，可以選擇性的消除死亡細(xì)菌細(xì)胞的DNA。這種方法通常和Real-time PCR 結(jié)合使用，用來(lái)檢測(cè)活性病原體，如肉類制品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157 ∶H7 和彎曲桿菌屬等［5］。此外，由于抗生素的濫用和生態(tài)環(huán)境的改變，通常需要同時(shí)檢測(cè)多種病原微生物。因此Real-time PCR與多重PCR 結(jié)合使用，能夠同時(shí)在同一反應(yīng)管內(nèi)檢測(cè)多種致病菌，效率更高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Real-time PCR 技術(shù)還有廣泛的發(fā)展空間。進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化Real-time PCR 技術(shù)并與其它技術(shù)結(jié)合使用，必將成為金黃色葡萄球菌等食源性致病菌檢測(cè)發(fā)展的重要趨勢(shì)。

［1］GB 19295-2011，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)速凍面米制品［S］.

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