人臍血CD34+造血干細胞的分離和體外擴增培養(yǎng)問題

王丹丹，賀雪萍，武文杰，李 茜，韓俊領(lǐng)

(協(xié)和干細胞基因工程有限公司，吉林長春300384)

干細胞(Stem Cells，SC)是一類多潛能細胞，還未充分分化，具有較強的自我復(fù)制能力。有研究表明臍帶血中含有大量的干細胞，無論是對外界刺激的反應(yīng)還是增殖能力都比骨髓干細胞強。在體外生長培養(yǎng)中也顯示出優(yōu)于骨髓干細胞的特點，比骨髓干細胞生長的更好，即更適合做體外擴增培養(yǎng)。本文通過對人臍血CD34+造血干細胞的分離以及體外培養(yǎng)的研究，探討其作為治療用種子細胞的可能性，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 UCB來源:人臍帶血由相關(guān)醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。

1.1.2 儀器和藥品:使用的主要儀器包括細胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺;細胞培養(yǎng)板，流式細胞儀;顯微鏡，照相機;電子天平，離心機;低溫冰箱等。

使用的藥品主要包括細胞因子 SCF、IL－3、IL－6、GCSF、EPO;青霉素、鏈霉素;NaCl、KCl;甲醇、乙醇;Na2HP04、KH2P04;Ficoll淋巴細胞分離液;胎牛血清;DMEM培養(yǎng)液。1.2 方法:采用胎盤娩出后采血法采集臍帶血，要求孕婦無產(chǎn)科，內(nèi)科合并癥以及其他血液疾病。采血過程由助產(chǎn)士幫助完成。在無菌條件下抽取臍帶血，注入無菌采血袋后置于4℃保存。24 h內(nèi)分離制備MNC懸液后用Isolex50免疫磁珠分離系統(tǒng)收集CD34+造血干細胞，用流式細胞儀檢測收集的CD34+純度后行體外擴增培養(yǎng)。通過血液涂片進行形態(tài)學(xué)觀察。根據(jù)細胞計數(shù)調(diào)整細胞懸液量，加入胎牛血清和DMEM溶液。在24孔培養(yǎng)板上做5組不同細胞因子組合的培養(yǎng)孔，以不加細胞因子的培養(yǎng)孔作為生長對照，每組重復(fù)三次，共培養(yǎng)6周。每周計數(shù)單個核細胞數(shù)和集落形成單位(CFU)。細胞因子分組為:(1)SCF+IL－3+IL－6;(2)SCF+IL－3+G－CSF;(3)SCF+IL－6+G－CSF;(4)SCF+IL－3+IL－6+G－CSF;(5)SCF+IL－3+IL－6+G－CSF+EPO。其中濃度分別為:SCF 100 ng/mL、IL－3 10 ng/mL、IL－6 50 ng/mL、G－CSF 80 ng/mL、EPO 2U。

1.3 數(shù)據(jù)分析:用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，對數(shù)據(jù)進行卡方檢驗。劑量資料采用平均數(shù)標準差表示。P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)流式細胞儀檢測，在分離后的細胞中CD34+造血干細胞占(81.31±4.57)%。在體外進行的細胞培養(yǎng)，其增殖能力有明顯差別。本研究中使用細胞因子的細胞培養(yǎng)孔的單個核細胞數(shù)明顯大于無細胞因子的細胞培養(yǎng)孔(P＜0.05)。此外，不同的細胞因子組合對擴增細胞的總數(shù)也有顯著的影響和差異，其中以第5種組合5種細胞因子聯(lián)合培養(yǎng)組單個核細胞增殖倍數(shù)最高，集落形成單位(CFU)形成率最高(P＜0.05)。結(jié)果顯示人臍血CD34+造血干細胞體外培養(yǎng)第13 d時達到高峰。

3 討論

臍帶血，指的是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后，殘留在臍帶內(nèi)以及胎盤近胎兒側(cè)血管內(nèi)的血液，其中含有大量干細胞，包括造血干細胞和間充質(zhì)干細胞等。干細胞具有較強的自我復(fù)制能力。胚胎干細胞在一定的環(huán)境條件下可以分化為多能干細胞。造血干細胞是多能干細胞的一種，是骨髓中的干細胞，它具有自我更新的能力，也能夠分化成為各種血細胞前體細胞并最終分化為各種血細胞，如紅細胞、白細胞和血小板。臍帶血可以重建骨髓造血和人體免疫，多用來治療骨髓衰竭以及嚴重的血液疾病，在一些遺傳病和嚴重的免疫缺陷疾病中也被廣泛應(yīng)用，并且獲得了一定的成功。有研究表明臍帶血中含有大量的干細胞，無論是對外界刺激的反應(yīng)還是增值能力都比骨髓干細胞強。在體外生長培養(yǎng)中也顯示出由于骨髓干細胞的特點，比骨髓干細胞生長的更好，即更適合做體外擴增培養(yǎng)［1］。臍帶血不僅含有豐富的干細胞，其分泌生長因子的能力也很強。此外，其端粒酶活性也遠遠高于骨髓和外周血干細胞，這些特點導(dǎo)致了臍帶干細胞擴增會有更強的分裂存活能力。

造血生長因子分為刺激增殖的刺激因子和維持細胞存活的存活因子。根據(jù)各種生長因子的不同功能，合理搭配可以起到協(xié)同作用。本研究結(jié)果表明SCF、IL－3、IL－6、GCSF、EPO5種細胞因子聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)CD34+造血干細胞體外擴增培養(yǎng)效果最好，且CD34+造血干細胞體外培養(yǎng)第13 d時達到高峰。目前，臍帶血造血干細胞的研究有不少成果，但至今成功移植的例子卻很有限。一方面是因為干細胞的數(shù)量較少;另一方面則是由于臍帶干細胞移植入成人骨髓的成功率較低［2］。所以，如何提高臍帶血造血干細胞的移植成功率，如何在體外擴增和培養(yǎng)臍帶血造血干細胞就成為了研究的熱點，也是其進一步發(fā)揮于臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用所要面對的重要挑戰(zhàn)。

［1］ 劉琰，華鋅，卯國強.人臍帶血細胞體外擴增的實驗研究和意義［J］.中華器官移植雜志，2001，22:336－338.

［2］ 羅偉瓊，陳慧珍，黃春柳，等.臍血采集方法、影響因素分析及注意事項［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，6(1):63 －64.