Survivin、NF-κB在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

楊志誠(chéng) 趙云剛 劉明雨

結(jié)直腸癌是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，居全世界惡性腫瘤死因的第二位，近年來(lái)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)［1］。侵襲轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌的重要死亡原因，也是影響臨床治療和預(yù)后的主要因素。研究表明，多種生物因子與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)凋亡抑制因子Survivin和核因子-κB(NF-κB)在65例結(jié)直腸癌標(biāo)本中的表達(dá)，探討Survivin和 NF-κB與結(jié)直腸癌病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2009年9月至2012年3月手術(shù)切除的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者標(biāo)本65例，其中，男38例，女27例;所有標(biāo)本均有明確病理分型，患者術(shù)前均未接受放療、化療;有結(jié)直腸癌家族史者不納入本試驗(yàn)。結(jié)腸癌35例，直腸癌30例;低分化癌28例，中、高分化癌37例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例;DukesA期13例，B期21例，C期28例，D期3例。并取40例患者癌旁正常組織，距腫瘤邊緣10 cm以上各1塊。中性甲醛固定，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并制備4 μm厚連續(xù)病理切片，切片分別進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 兔抗人Survivin、NF-κB多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，SP試劑盒、DAB試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司。切片脫蠟至水，采用免疫組織化學(xué)鏈霉素-生物素過(guò)氧化酶(SP)染色法，切片置于抗原修復(fù)液(0.01 mol/L檸檬酸鹽)中高壓鍋熱修復(fù)30 min，在3%H2O2-甲醇溶液中浸泡10 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，10%山羊血清封閉10 min，加入 Survivin抗體(稀釋度1∶200)、NF-κB 抗體(稀釋度 1∶300)，4℃過(guò)夜，免疫組織化學(xué)染色均按SP試劑盒推薦方法進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判斷 細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為Survivin陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞。判斷采用半定量積分法［2］，記數(shù)5個(gè)高倍視野，將平均陽(yáng)性細(xì)胞率分為5類(lèi):0分＜5%;1分5% ～＜25%;2分25% ～＜50%;3分50% ～＜75%;4分≥75%。根據(jù)陽(yáng)性染色強(qiáng)度分為4類(lèi):無(wú)著色0分;淡黃色1分;黃色2分;棕黃色3分;兩者積分相加，按積分高低分為:0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～5分為陽(yáng)性(++)，6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。把弱陽(yáng)性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性均定義為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、四格表概率法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、NF-κB在結(jié)直腸癌組織中及癌旁正常組織中的表達(dá) Survivin蛋白陽(yáng)性反應(yīng)物主要位于癌旁和癌細(xì)胞胞質(zhì)中，為淺黃和棕黃色，染色均勻，癌組織表達(dá)的陽(yáng)性率為72.31%(47/65)。正常大腸黏膜中未見(jiàn) Survivin蛋白表達(dá)，癌組織與對(duì)照非癌組織中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。NF-κB蛋白陽(yáng)性反應(yīng)物位于胞漿和(或)細(xì)胞核，結(jié)直腸癌中NF-κB的陽(yáng)性率為58.46%(38/65)，癌旁正常組織的陽(yáng)性率為17.5%(7/40)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 Survivin、NF-κB在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Survivin、NF-κB蛋白的陽(yáng)性表達(dá)均與患者的年齡、性別、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)，與癌組織的Dukes分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.01)。

2.3 Survivin、NF-κB蛋白在結(jié)直腸癌中表達(dá)的關(guān)系 47例Survivin陽(yáng)性表達(dá)病例中NF-κB陽(yáng)性表達(dá)32例，18例Survivin陰性表達(dá)病例中NF-κB陽(yáng)性表達(dá)6例，Survivin與NF-κB的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.373，P=0.012)。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野的Survivin與NF-κB均表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)，Survivin與NF-κB 的陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.75，P＜0.01)。

3 討論

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展機(jī)制尚未完全明了。NF-κB存在于體內(nèi)多種細(xì)胞中，NF-κB與其調(diào)節(jié)蛋白IKB-α結(jié)合后在細(xì)胞質(zhì)中以非活性形式存在，通過(guò)IKB激酶(IKK)作用，IKB-α可發(fā)生32、36位的絲氨酸磷酸化而降解，并與NF-κB分離，NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，迅速誘導(dǎo)靶基因 mRNA的合成，參與多種疾病的發(fā)病過(guò)程［3］。在腫瘤細(xì)胞中，NF-κB可以調(diào)節(jié)許多基因，包括增殖相關(guān)基因(cyclinD1，COX2，and c-Myc)、抗凋亡相關(guān)基因(survivin，Bcl-2)、侵襲相關(guān)基因(MMP-9 and ICAM-1)等［4］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NF-κB在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為58.46%，與對(duì)照非癌組織的陽(yáng)性率17.5%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的凋亡抑制可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要作用［5］。

Survivin是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，可抑制多種刺激因素誘導(dǎo)的凋亡，使細(xì)胞存活，有利于細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［6］。Survivin可能通過(guò)下列途徑抑制細(xì)胞凋亡:(1)抑制凋亡終末效應(yīng)蛋白 caspase-3、caspase-7的活性，從而有效的阻斷細(xì)胞凋亡過(guò)程［7］。(2)與細(xì)胞周期調(diào)控因子周期蛋白激酶CDK4形成復(fù)合體，使 p21從CDK4復(fù)合體中釋放出來(lái)，并移位到線粒體中與caspase3特異性結(jié)合，間接抑制caspase3活化，阻止線粒體釋放細(xì)胞色素 C，從而起到抗凋亡作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，Survivin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率為72.31%，與對(duì)照非癌組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在結(jié)直腸癌組織中，Survivin與NF-κB之間表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.75)。并且 Survivin、NF-κB蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與癌組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期相關(guān)(P＜0.01)，說(shuō)明 NF-κB及 Survivin在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要作用。

1 Weir HK，Thun MJ，Hankey BF，et al.Annual report to the nation on the status of cancer，1975-2000，featuring the uses of surveillance data for cancer prevention and control.J Natl Cancer Inst，2003，95:1276-1299.

2 Kawasaki H，Altieri DC，Lu CD，et al.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer.Cancer Res，1998，58:5071-5074.

3 KarinM.NF-kappa B and cancer:mechanisms and targets.Mol Carcinog，2006，45:355-361.

4 Yang P，Guo L，Duan ZJ，et al.Histone Methyltransferase NSD2/MMSET Mediates Constitutive NF-κB Signaling for Cancer Cell Proliferation，Survival，and TumorGrowth via a Feed-Forward Loop.Mol Cell Biol，2012，32:3121-3131.

5 Yoriaki S，Takehiko K，Takashi Y，et al.The incidence of apoptosis during colorectal tumorigenesis.Int J Surg Pathol，2000，8:123-132.

6 Angela F，Natalie R，Sam W，et al.Survivin，a member of the inhibitor of apoptosis family，is iInduced by photodynamic therapy and is a target for improving treatment response.Cancer Res，2007，67:4989-4995.

7 Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase 3/p21complex formation as a result ofinteraction with cdk4 to resist Fas-mediated cell death.Oncogene，2000，19:1346-1353.

8 Sah NK，Khan Z，Khan GJ，et al.Structural functional and therapeutic biology of Survivin.Cancer Lett，2006，244:164-171.