Toll樣受體及其在尿路感染發(fā)病中的作用研究進展

黃 紅，那 宇

(1 安徽醫(yī)科大學解放軍306臨床醫(yī)院，北京 100101;2 中國人民解放軍306醫(yī)院)

目前，泌尿系統(tǒng)的獲得性免疫已經(jīng)獲得廣泛研究，而固有免疫的研究雖已開展120多年，研究的方向卻很局限。既往研究大多數(shù)局限在皮膚或黏膜的屏障作用、體液的殺菌作用、單核巨噬細胞及粒細胞的吞噬作用、自然殺傷(NK)細胞的殺傷作用、炎性因子的炎癥作用等方面。隨著20世紀90年代模式識別受體(PRR)概念的提出，特別是Toll樣受體(Toll-Like Receptors，TLRs)的發(fā)現(xiàn)，泌尿系統(tǒng)的固有免疫研究進入一個嶄新的階段?，F(xiàn)將TLRs及其在尿路感染發(fā)病中作用的研究進展綜述如下。

1 TLRs在泌尿系統(tǒng)的分布

目前已發(fā)現(xiàn)，哺乳動物中的TLRs至少有13種，其中在人體表達的TLRs為TLR1～TLR10。整個尿路包括尿道、膀胱、輸尿管中均有多種TLRs的分布。Pudney等［1］對正常男性和HIV陽性患者生殖系統(tǒng)進行的研究發(fā)現(xiàn)，男性尿道海綿部的白細胞內(nèi)有TLR2、TLR3、TLR5、TLR7 和 TLR9 表達，并且是生殖系統(tǒng)中表達TLRs最多的部位，前列腺上皮細胞內(nèi)也有各種 TLRs的表達。Ayari等［2］通過反轉(zhuǎn)錄方法發(fā)現(xiàn)，正常人膀胱上皮細胞可表達 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7 和 TLR9。徐華超等［3］從腎全切除術的腎腫瘤患者腎臟組織中分離腎小管、腎盂、輸尿管和膀胱上皮，進行原代培養(yǎng)和細胞鑒定，也發(fā)現(xiàn)上述組織均有TLR2和TLR4的表達。

目前泌尿系統(tǒng)中研究最多的三種TLRs是TLR4、TLR5和TLR11。TLR4在膀胱和腎臟均有表達，TLR5主要在膀胱表達，TLR11主要在腎臟表達［4］。以TLR4在膀胱炎中的固有免疫研究最為深入。TLR11主要在小鼠腎臟表達，缺乏TLR11的小鼠腎臟表現(xiàn)出對致腎盂腎炎細菌的高度易感性。人類缺乏 TLR11的表達，雖然實驗證明人體存在TLR11的短縮形式 ，但呈失活狀態(tài)，此可能為人體易發(fā)生泌尿系感染的重要原因［5］。

2 TLRs識別的配體

TLRs屬于I型跨膜蛋白，其胞內(nèi)區(qū)與IL-1受體的胞內(nèi)區(qū)相似，稱為TIR(Toll/IL-1 receptor homologous region)，負責受體活化后的信號轉(zhuǎn)導，而胞外區(qū)結構有富含亮氨酸的重復序列，負責識別不同的病原分子。針對不同的病原體，TLRs可識別不同生物上的病原體相關分子模式(PAMPs)，每一類TLR單獨或與輔助因子結合可識別一種或幾種PAMPs。

TLR1可識別三酰基脂肽、可溶性因子。TLR2主要識別G+細菌的肽聚糖、脂蛋白和脂磷酸壁，亦可識別G-細菌的脂蛋白、支原體和螺旋體、真菌或膜孔蛋白的酵母聚糖、腎臟鉤端螺旋體等。TLR4主要識別G-細菌細胞壁的脂多糖(LPS)成分。除LPS外，TLR4還可識別磷壁酸、呼吸道合胞病毒F蛋白等配體。TLR5可識別細菌的鞭毛，鞭毛素D295和D367區(qū)域是細菌鞭毛的主要組成部分，可與TLR5在細胞表面結合。TLR6可識別支原體的二?；鞍?、G+細菌的胞壁酸、真菌的酵母多糖等。TLR9可識別未甲基化CpG-DNA。TLR11可識別尿路致病性大腸桿菌(UPEC)，其配體目前還不清楚，且不存在于非致病性大腸埃希菌和G+細菌中。此外還有TLR3、TLR7、TLR9，被認為是最主要的識別病毒核酸的模式識別受體［6］。最近研究表明，TLRs還可識別某些內(nèi)源性配體，如 TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6 可識別熱休克蛋白、壞死的小管細胞及細胞外基質(zhì)成分等［7］。

細菌、真菌、支原體、衣原體、病毒、寄生蟲等均能引起尿路感染。因為95%以上的尿路感染是G-細菌感染，故TLR4在尿路感染者固有免疫中的作用最顯著。TLR11因配體尚不清楚，成為目前研究的重點。2005年Yarovinsky等［8］對鼠弓形蟲的研究證實，弓形蟲內(nèi)的一種Profiling樣蛋白可通過與TLR11結合激活樹突狀細胞(DC)，啟動骨髓分化蛋白88(MyD88)依賴性信號通路，首次從化學上定義了TLR11的配體。近年研究發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲成蟲體內(nèi)存在與鼠弓形蟲中的Profiling樣蛋白有相似結構域的一種蛋白，血吸蟲成蟲體內(nèi)能否找到與TLR11結合的配體成為今后的一個研究方向。此外，TLR11與TLR5具有相似的多態(tài)現(xiàn)象，人尿道細菌菌毛上是否存在一種鞭毛樣蛋白能與TLR11結合亦為今后研究的焦點。目前關于TLRs在G-細菌感染中的研究已經(jīng)很多，在其他病原體感染中所扮演的角色也越來越受到關注［9］。

3 TLRs信號轉(zhuǎn)導途徑

3.1 經(jīng)典途徑 即MyD88-NF-κB途徑。所有的TLRs均可啟動MyD88依賴途徑，且在尿路各段發(fā)生炎癥時都可啟動。此途徑有四類接頭蛋白:MyD88、包含TIR的接頭蛋白、包含TIR的接頭分子1(TICAM-1)、TICAM-2。其中MyD88是TLR信號轉(zhuǎn)導中最重要的連接蛋白，位于胞內(nèi)，是TIR的接頭蛋白，由一個N端死亡域(DD)和一個 C端 TIR(Toll/IL-1R)域組成。配基與TLR胞外段結合，使之二聚化并與MyD88的Toll結構域結合，同時誘導MyD88的DD活化，MyD88通過DD募集含有DD結構域的信號分子并使信號向下傳導，可激活NF-κB。NF-κB活化后游離釋放并轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子一起協(xié)同誘導促炎因子IL-1、IL-6、IL-8等基因的表達，參與天然免疫應答。

3.2 MyD88非依賴途徑 MyD88非依賴性信號傳導途徑是某些TLRs(如TLR3、TLR4)所特有，β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TRIF)是其中的一個接頭蛋白，主要參與INF-β調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)激活。TLR4可通過接頭分子Trif介導下游的信號傳導，激活轉(zhuǎn)錄因子IRF-3和NF-κB，繼而介導一系列 NF-κB參與的基因表達、激活Caspase及誘導共刺激分子表達。

經(jīng)典途徑被認為是尿路感染固有免疫最重要的途徑。但最新研究表明，在膀胱炎中存在一種cAMP/cAMP反應元件結合蛋白(CREB)途徑，且此途徑比經(jīng)典途徑更迅速、快捷［10］。此信號途徑的啟動需要cAMP首先和它相關的傳遞因子CREB結合。膀胱表面淺層上皮細胞(BECs)上的腺苷酸環(huán)化酶(AC)可引起細胞內(nèi)cAMP上升。AC有四種亞型，其中 AC3為細胞暴露于大腸埃希菌后產(chǎn)生cAMP上升的特異亞型，升高的cAMP可經(jīng)過蛋白激酶A(PKA)使CREB磷酸化，后者可使IL-6、IL-8表達上調(diào)。

4 TLRs與尿路感染

盡管很多種TLRs都在泌尿系統(tǒng)表達，但目前發(fā)現(xiàn)只有TLR4、TLR5和TLR11在活體感染時發(fā)揮抗菌作用。上述三種基因敲除的小鼠在尿路任意區(qū)域發(fā)生感染時抗感染能力均減退［4］。在尿路感染中作用最明確的是TLR4。任何細胞缺乏TLR4均將會損傷機體對UPEC的防御機制，增加無癥狀菌尿(ASB)或膿尿的患病率。Tamm-Horsfall蛋白是健康人尿液中具有抗菌活性的蛋白，可通過TLR4信號途徑減輕腎臟炎癥損傷和穩(wěn)定腎外髓質(zhì)［11］，此進一步證實TLR4在防御泌尿系感染中發(fā)揮重要作用。

4.1 膀胱炎 TLR4在膀胱發(fā)揮固有免疫作用主要表現(xiàn)在以下三個方面:激活信號轉(zhuǎn)導，產(chǎn)生細胞因子，發(fā)揮抗炎作用;抑制細菌侵入;促進細菌排出。TLR4與協(xié)同受體CD14廣泛表達在鼠和人類BECs上，BECs表面的 TLR4/CD14復合物識別 G-菌的LPS后可激活兩種轉(zhuǎn)導途徑(經(jīng)典途徑和cAMP/CREB途徑)，最終均通過促進IL-6、IL-8的分泌發(fā)揮抗感染作用［10］。在膀胱壁淺層內(nèi)存在一種紡錘體小囊泡，其為一種動態(tài)cAMP調(diào)節(jié)的圓盤狀小囊泡，這些小囊泡高度富集脂筏成分，UPEC侵入BECs后裝入這些小囊泡內(nèi)［4］。故BECs上的TLR4還可通過激活cAMP/CREB途徑調(diào)節(jié)cAMP的表達從而抵御UPEC的侵入。細胞內(nèi)增加的cAMP通過下游的效應分子PKA發(fā)揮級聯(lián)效應抑制Rac-1的活性。Rac-1是BECs上脂筏決定簇的組成成分，并且是肌動蛋白重組和細菌侵入的必要元件。BECs在UPEC侵入細胞后仍能通過TLR4的激活排除細菌，此過程涉及的主要物質(zhì)仍然是cAMP，因為細胞內(nèi)的cAMP是紡錘體小囊泡及其攜帶的細菌發(fā)生胞吐的一個強有力的啟動子。Bishop等［12］報道，用Forskolin(一種能提高胞內(nèi)cAMP的物質(zhì))處理小鼠，能夠引起膀胱紡錘體小囊泡進入淺層漿膜崩潰，隨之UPEC在感染的膀胱內(nèi)數(shù)量下降。

4.2 腎盂腎炎 發(fā)生腎盂腎炎時，帶有I型菌毛或P菌毛的UPEC優(yōu)先黏附到髓質(zhì)集合管上皮細胞上形成菌落。一方面機體通過釋放ɑ-溶血素刺激Ca2+釋放，繼而促進 IL-6、IL-8的釋放;另一方面UPEC菌毛的LPS成分被TLR4識別，通過MyD88-NF-κB途徑引起腎小管上皮細胞產(chǎn)生細胞因子，趨化中性粒細胞啟動固有免疫［13］。有研究者通過TLR4突變鼠和野生鼠之間骨髓交叉移植制造了一種新動物模型，結果發(fā)現(xiàn)在UPEC感染后，缺乏功能性TLR4小鼠的腎實質(zhì)細胞不能募集中性粒細胞，不易形成腎膿腫，但在腎內(nèi)有很多UPEC菌團［14］。以往認為TLR4基因缺失僅可導致ASB;最新研究發(fā)現(xiàn)，TLR4發(fā)揮固有免疫的另一條途徑即MyD88非依賴途徑中的IRF-3基因缺失時，機體將發(fā)生嚴重腎臟感染［15］。IRF-3基因缺失的小鼠與對照組相比，早期腎膿腫形成無明顯差異，但后期對照組可更早的呈現(xiàn)修復狀態(tài)。此研究還通過制作LPS敏感及不敏感、MyD88基因缺失的小鼠模型，進一步證實TLR4在腎臟感染時發(fā)揮重要作用。

4.3 ASB 新近發(fā)現(xiàn)，ASB的發(fā)生與宿主的TLR表達有關。ASB患兒中性粒細胞的TLR4表達水平明顯低于健康小兒，且原發(fā)ASB患兒的TLR4表達水平明顯低于初次尿路感染后繼發(fā)ASB患兒。ASB患兒的TLR4接頭蛋白水平升高，TLR4抑制因子水平下降。Fischer等［16］發(fā)現(xiàn)，TLR4敲除的小鼠可表現(xiàn)為ASB;Suhs等［17］發(fā)現(xiàn)，TLR4缺陷位點的C3H/HeJ小鼠不能清除實驗性的UTI，可能是由于不能吸引中性粒細胞聚集到感染的膀胱部位，最終使患者成為一個ASB攜帶者。

總之，TLRs可控制微生物的致病性、激活宿主的黏膜防御、導致細菌清除，其表達水平及功能與宿主泌尿系感染的類型及轉(zhuǎn)歸密切相關。對于尿路感染，目前抗菌藥物治療效果越來越不理想，調(diào)節(jié)尿道固有免疫系統(tǒng)功能可能成為新的策略，化學藥物結合“TLR免疫療法”(如發(fā)現(xiàn)或合成某種物質(zhì)上調(diào)TLRs的表達，或用抗TLRs特異性抗體、構建TLR s缺失基因轉(zhuǎn)染相關細胞來提高機體對尿路致病菌的抵抗與清除能力)亦具有發(fā)展前景。

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