地中海貧血骨髓移植中造血干細(xì)胞狀態(tài)及功能的研究

李續(xù)娥 ，李 峰

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631)

地中海貧血(簡(jiǎn)稱地貧，thalassemia)是世界上常見(jiàn)的遺傳性血液病之一. 其分子基礎(chǔ)為珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致珠蛋白鏈合成障礙，使形成血紅蛋白四聚體的α－鏈/非α－鏈比例失衡，進(jìn)而引起紅細(xì)胞破壞而溶血［1］.1925年，Thomas Cooley 和Pear Lee首次對(duì)這種發(fā)生在意大利兒童的嚴(yán)重貧血進(jìn)行了描述.因?yàn)樵缙诘牟±鶃?lái)自于地中海地區(qū)，故稱為地中海貧血或海洋性貧血.以后逐漸發(fā)現(xiàn)這種疾病還發(fā)生在東南亞、美國(guó)黑人、印度次大陸，我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)的發(fā)病率也較高，特別是廣東、廣西更為常見(jiàn)［2］.

1 地中海貧血骨髓移植的預(yù)處理方案及危險(xiǎn)等級(jí)

1.1 骨髓移植是治愈地貧的唯一方法

地中海貧血是一種進(jìn)展性疾病，目前通過(guò)規(guī)律輸血和使用除鐵劑來(lái)提高生活質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期，但英國(guó)的調(diào)查報(bào)告顯示:地貧患兒從10 歲開(kāi)始，生存期出現(xiàn)恒定的下降，有50%以上的患者在35 歲前死亡，主要的原因是靜脈輸注去鐵胺(desferrioxamine)的順應(yīng)性太差. 目前雖然有2個(gè)新的口服除鐵劑(去鐵酮deferiprone 和地拉羅司deferasirox)已經(jīng)使用于臨床，但其長(zhǎng)期的療效有待進(jìn)一步證實(shí).對(duì)于一個(gè)終身輸血的地貧患者，即使采用嚴(yán)格的除鐵治療，亦只能大體上減少而未能根除鐵的過(guò)載.經(jīng)過(guò)了20 多年的研究，實(shí)驗(yàn)和臨床的資料顯示，地貧的基因治療可能引起許多不良反應(yīng). 盡管在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有所進(jìn)展，但進(jìn)入臨床應(yīng)用尚無(wú)時(shí)刻表［3］.

自Thomas 和他的同事于1982年首先報(bào)道了第一例成功的人類白細(xì)胞抗原相合同胞骨髓移植治療地貧病例以來(lái)，異基因造血干細(xì)胞移植(即骨髓移植)開(kāi)始被用于治愈地貧.至今，骨髓移植仍被認(rèn)為是治愈地貧的唯一方法. 我國(guó)大陸地貧病人骨髓移植起步較晚，總例數(shù)目前約300 多例，主要分布在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院、中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院等廣州幾家大醫(yī)院中.

1.2 地貧骨髓移植的預(yù)處理方案及危險(xiǎn)等級(jí)

地貧骨髓移植預(yù)處理的目的是根除異常造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)和建立耐受環(huán)境以利正常HSCs 的生存和發(fā)育. 全身放療可以同時(shí)達(dá)到這2個(gè)目的，但在白血病等的治療中發(fā)現(xiàn)其能導(dǎo)致生長(zhǎng)滯后和二次腫瘤發(fā)生率增多，使全身放療的應(yīng)用受到了限制，特別對(duì)于具有較長(zhǎng)生命期的年幼者.白消安(Bu)及其衍生物在治療非惡性血液病和先天性代謝病方面有相當(dāng)多的經(jīng)驗(yàn).Bu 對(duì)骨髓－紅系軸最原始的前體具有優(yōu)良特異性. 骨髓致死劑量的Bu 對(duì)淋巴系統(tǒng)毒性很小，幾乎不引起免疫抑制.環(huán)磷酰胺(Cy)在再生障礙性貧血異基因骨髓移植治療中具有保障植入的適當(dāng)免疫抑制作用，Cy 200 mg/kg 分4 天使用，能使白血病骨髓移植恒定植入.因此，至今大多數(shù)移植中心地貧移植預(yù)處理仍然以Bu/Cy 為基礎(chǔ)［3］.

對(duì)預(yù)處理方案完全相同的年齡小于17 歲的161 例地貧骨髓移植治療效果進(jìn)行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)肝腫大超過(guò)2 cm、肝臟纖維化和不正規(guī)使用去鐵胺為3個(gè)危險(xiǎn)因素，顯著地降低了移植后的生存率.正規(guī)去鐵胺使用被定義為開(kāi)始輸血后18個(gè)月內(nèi)使用和皮下注射8～10 h 每周至少5 次. 這樣可將地貧患者分成3個(gè)危險(xiǎn)等級(jí):Ⅰ級(jí)，3個(gè)危險(xiǎn)因素均沒(méi)有;Ⅱ級(jí)，有1～2個(gè)危險(xiǎn)因素;Ⅲ級(jí)，3個(gè)危險(xiǎn)因素均有［4］.

按照意大利Pesaro 的經(jīng)驗(yàn)，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)患者使用14 mg/kg 的Bu 及200 mg/kg 的Cy 處理，而Ⅲ級(jí)患者使用低劑量的Cy(120～160 mg/kg). ISSARAGRISIL［5］總結(jié)了其在泰國(guó)26 例地貧骨髓移植的經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)14 mg/kg 的Bu 可以引發(fā)40%的排斥風(fēng)險(xiǎn)，而20 mg/kg 的Bu 可顯著降低排斥風(fēng)險(xiǎn).FANG等［6］使用20 mg/kg 的Bu 配合馬法蘭(Melph)與噻替哌(T T)亦使7 名患者中的6 名獲得移植的成功.SLAVIN 等以氟達(dá)拉濱(fludarabine)和抗淋巴細(xì)胞球蛋白強(qiáng)效的免疫抑制劑為基礎(chǔ)的半量Bu 非清髓性預(yù)處理方案，治療了一組包括地中海貧血在內(nèi)的非惡性血液病，取得了較好的效果［7］. 近十多年，抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)、羥基脲(hydroxyurea)、硫唑嘌呤(azathioprine)和氟達(dá)拉濱(fludarabine)也被適當(dāng)加入到Bu/Cy 方案中，以增加高風(fēng)險(xiǎn)患者的無(wú)病生存率和降低移植相關(guān)死亡率.

2 HSCs 狀態(tài)和功能的研究

作者在探討紅景天苷(Salidroside，SD)是否通過(guò)激活與DNA 修復(fù)相關(guān)的Parp－1 酶活性而維持小鼠HSCs 的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)HSCs 的狀態(tài)及功能進(jìn)行了詳細(xì)的研究［8］，首先發(fā)現(xiàn)腹腔注射SD(75 μg/g)幾乎能完全消除H2O2(0.25 μmol/g)引起的小鼠(WT C57BL/6)骨髓中CD34－Flt3－LSK(Lin－c-kit+Sca-1+)細(xì)胞(即長(zhǎng)期HSCs)數(shù)量的減少;改用CD150+CD48－LSK 免疫分型法檢測(cè)，亦得到同樣的結(jié)果.接著，將上述處理小鼠(CD45.2+)的1 000個(gè)LSK 細(xì)胞與1 ×106來(lái)自Boy J 小鼠(CD45.1+)的骨髓細(xì)胞(缺乏c-kit+)混合后移植到致死劑量放射處理的Boy J 受體小鼠，4個(gè)月后檢測(cè)供體CD45.2+細(xì)胞在受體外周血及骨髓LSK 群中的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)SD 能顯著增加移植細(xì)胞造血功能的競(jìng)爭(zhēng)重建;取第1 次移植4個(gè)月后的受體骨髓細(xì)胞進(jìn)行第2 次移植，得知SD 亦能明顯增強(qiáng)移植細(xì)胞的長(zhǎng)期造血重建功能.

為了確定SD 在氧化應(yīng)力下維持HSCs 數(shù)量及造血重建功能的原因，我們測(cè)定了其對(duì)H2O2處理小鼠的骨髓CD34－LSK 細(xì)胞群凋亡的影響，并未看到SD 阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生.通過(guò)Pyronin Y 和Hoechst 33342 染色RNA 和DNA 檢測(cè)了CD34－LSK細(xì)胞群中靜止期(G0)的細(xì)胞數(shù)量，通過(guò)5－ 溴－2 脫氧尿核苷(BrdU)標(biāo)記檢測(cè)了CD34－LSK 細(xì)胞群中DNA 合成期的細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)SD 能消除氧化應(yīng)力引起的HSCs 進(jìn)入細(xì)胞周期的作用.

SD 的抗氧化作用是否與清除活性氧(reactive oxygen species，ROS)有關(guān)?用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了H2O2處理小鼠骨髓中新鮮分得的Lin－細(xì)胞的DNA損傷情況，用Western－blot 檢測(cè)了DNA 損傷相關(guān)的表達(dá)物組蛋白γ－H2AX 和8－羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8－oxodG)，發(fā)現(xiàn)和四羥甲基季(4－苯甲酸)卟啉錳(Ⅲ)(manganese (Ⅲ)tetrakis (4－benzoic acid)porphyrin，MnTBAP)和N－ 乙酰半胱氨酸(N－ acetyl－L－cysteine，NAC)一樣，SD 能明顯消除H2O2引起的DNA 損傷.但采用熒光探針(CM-H2 DCFDA)檢測(cè)骨髓CD34－LSK 細(xì)胞群的ROS，發(fā)現(xiàn)SD 與MnTBAP、NAC 不同，不能消除H2O2引起的ROS 增加.對(duì)骨髓中的單核細(xì)胞經(jīng)SD、MnTBAP 和NAC 處理2 h，再經(jīng)H2O2處理2 h，檢測(cè)隨后0、2、4、8、12 h其8－oxodG 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn):SD 能在氧化處理4 h 后開(kāi)始降低8－oxodG 的表達(dá)，在12 h 幾乎無(wú)8－oxodG的表達(dá);而MnTBAP、NAC 在各時(shí)間點(diǎn)上均減少了8－oxodG 的表達(dá);彗星實(shí)驗(yàn)亦顯示了同樣的DNA修復(fù)動(dòng)力學(xué).說(shuō)明與MnTBAP、NAC 不同，SD 的抗氧化作用機(jī)理與ROS 清除無(wú)關(guān).

為了明確SD 在氧化應(yīng)力下對(duì)HSCs 維持的作用機(jī)理，作者選擇了5 種缺乏不同DNA 修復(fù)途徑的小鼠Brca2－/－、DNA－PKcs3A/3A、Xpc－/－、Fancd2－/－以及Parp－1－/－進(jìn)行了彗星實(shí)驗(yàn)及8－oxodG 表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SD 只對(duì)H2O2引起的Parp－1－/－(缺少編碼PARP－1 酶基因)小鼠的Lin－細(xì)胞的DNA 損傷的修復(fù)無(wú)作用;同樣，SD 只對(duì)H2O2處理的Parp－1－/－小鼠骨髓中LSK 細(xì)胞PARP－1 酶活性無(wú)增加作用;用PAR、PARP－1 抗體進(jìn)行的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)亦得到同樣的結(jié)果. 說(shuō)明SD 抗氧化作用需要通過(guò)PARP－1 酶的參與. 進(jìn)一步比較SD 對(duì)H2O2處理的Parp－1+/+和Parp－1－/－小鼠骨髓中CD34－LSK 細(xì)胞G0期的影響，以及SD 與8－羥基－2－甲基喹唑啉酮(PARP－1 酶活性抑制劑)對(duì)H2O2處理的這2 種小鼠的共同作用，均發(fā)現(xiàn)SD 通過(guò)激活PARP－1 酶活性增加HSCs 在G0期的數(shù)量. 另外，將Parp－1+/+和Parp－1－/－小鼠骨髓中LSK 細(xì)胞移植到致死劑量照射的受體小鼠4月后，發(fā)現(xiàn)SD需要激活PARP－1 酶活性方可明顯減少H2O2引起的供體CD34－LSK 細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)的數(shù)量;將上述SD 和H2O2處理后的一次移植受體小鼠的骨髓細(xì)胞再二次移植到致死劑量照射的受體小鼠4月后，顯示，SD 同樣需要激活PARP－1 酶活性方能增加供體細(xì)胞在受體中的長(zhǎng)期造血重構(gòu)功能.表明SD的確通過(guò)激活與DNA 修復(fù)相關(guān)的PARP－1 酶活性發(fā)揮其抗氧化作用，以維持HSCs 的數(shù)量和造血重構(gòu)功能.

在另一研究中［9］，為了確定白細(xì)胞介素－3 受體α(IL－3Rα)在干細(xì)胞CD34+CD38－中的過(guò)量表達(dá)就是范可尼貧血急性髓性白血病(FA AML)的干細(xì)胞特征，作者將正常人的CD34+細(xì)胞、FA AML 病人的CD34+IL－3Rα+和CD34+IL－3Rα－細(xì)胞異種移植到亞致死量照射的NSG/SGM3 (NOD scid IL－2rγ－/－/SCF，GM－CSF and IL－3)小鼠，6 周后發(fā)現(xiàn)正常人的CD34+細(xì)胞、FA AML 病人的CD34+IL－3Rα+細(xì)胞能夠成功移植，而且正常人CD34+細(xì)胞移植后不表達(dá)IL－3Rα，F(xiàn)A AML 病人CD34+細(xì)胞移植后表達(dá)IL－3Rα. 為了觀察白血病的發(fā)展又進(jìn)行了二次移植，接受FA AML 病人CD34+IL－3Rα+細(xì)胞移植的9 只小鼠在移植后的15 周內(nèi)均發(fā)展為白血病，接受其他2 種細(xì)胞移植的小鼠在移植后4個(gè)月內(nèi)均無(wú)白血病的特征出現(xiàn).進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，IL－3Rα 在正常人的CD34+CD38－干細(xì)胞中是不表達(dá)的，而在FA AML 的CD34+CD38－干細(xì)胞中高度表達(dá).說(shuō)明IL－3Rα 的過(guò)表達(dá)是FA AML 干細(xì)胞的特有標(biāo)志.

我們已有的研究包括了HSCs 的狀態(tài)(數(shù)量、在細(xì)胞周期的分布、活性氧的狀態(tài)、凋亡情況、DNA 損傷程度、DNA 損傷相關(guān)酶活性)和功能(同種和異種一次移植和二次移植后受體小鼠體內(nèi)造血重建功能)的內(nèi)容.而地貧HSCs 的研究只涉及其移植前后的動(dòng)脈機(jī)能失調(diào)與血液循環(huán)中的CD133+VEGFR2+和CD34+VEGFR2+細(xì)胞的增殖關(guān)系、原有的血液高凝集狀態(tài)的改善、HSCs 中CD34+細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析等［10－13］，未見(jiàn)關(guān)于地貧HSCs 狀態(tài)及功能的研究.

3 地中海貧血骨髓移植與HSCs 研究相結(jié)合的發(fā)展趨勢(shì)

3.1 根據(jù)預(yù)處理過(guò)程中HSCs 的根除情況調(diào)整預(yù)處理方案是臨床發(fā)展的趨勢(shì)

地貧移植排斥是移植的一個(gè)重要問(wèn)題.移植后殘留的宿主干細(xì)胞百分比可以作為患者移植排斥的預(yù)測(cè)因子.當(dāng)宿主干細(xì)胞的殘留超過(guò)25%時(shí)幾乎所有的患者發(fā)生移植排斥;宿主干細(xì)胞的殘留介于10%～25%時(shí)，排斥的風(fēng)險(xiǎn)是41%;當(dāng)宿主干細(xì)胞的殘留少于10%時(shí)僅有13%的患者發(fā)生排斥［14－15］.可見(jiàn)在骨髓移植預(yù)處理過(guò)程中對(duì)宿主干細(xì)胞根除情況的檢測(cè)，能提高臨床骨髓移植治療地貧的成功率，是未來(lái)地貧進(jìn)行骨髓移植治療的發(fā)展趨勢(shì).

通過(guò)分析不同地貧患者預(yù)處理過(guò)程中其HSCs的狀態(tài)(數(shù)量、在細(xì)胞周期的分布、活性氧的狀態(tài)、凋亡情況、DNA 損傷程度、DNA 損傷相關(guān)酶活性)和功能(體外的集落檢測(cè)、NOD/SCID 小鼠體內(nèi)造血重建功能)，實(shí)時(shí)了解殘留宿主HSCs 的情況，判斷預(yù)處理是否達(dá)到根除異常HSCs 的目的，為現(xiàn)有骨髓移植預(yù)處理方案的調(diào)整提供科學(xué)指導(dǎo).

3.2 用HSCs 狀態(tài)與功能評(píng)價(jià)地貧患者骨髓移植危險(xiǎn)等級(jí)是未來(lái)的趨勢(shì)

重型地中海貧血患者病情程度與移植前預(yù)處理方案及移植效果密切相關(guān)，如前所述，目前臨床上通常采用意大利Pesaro 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)病情程度進(jìn)行分級(jí).但Pesaro 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)中肝臟腫大的評(píng)價(jià)指標(biāo)比較粗糙，肝臟纖維化評(píng)價(jià)需通過(guò)創(chuàng)傷性的活檢穿刺才能進(jìn)行.考慮到地貧患者的肝脾腫大、骨骼重構(gòu)是由于紅系的迅速分化，造成骨髓極度增生，并進(jìn)行性擴(kuò)展到通常骨髓細(xì)胞不存在的髓內(nèi)和髓外區(qū)域的結(jié)果，因此可以嘗試用骨髓的狀態(tài)評(píng)價(jià)地貧移植的危險(xiǎn)等級(jí).沈君等［16］對(duì)27 例擬行骨髓移植的重型地中海貧血患兒的股骨骨髓進(jìn)行磁共振成像(MRI)檢查，發(fā)現(xiàn)地中海貧血患者，由于骨髓無(wú)效造血、髓內(nèi)溶血，引起了紅骨髓增生，MRI 上表現(xiàn)為黃骨髓逆轉(zhuǎn)為具有造血能力的紅骨髓;另一方面，由于反復(fù)輸血、腸道的鐵被過(guò)分吸收，骨髓內(nèi)亦出現(xiàn)鐵沉積信號(hào).認(rèn)為MRI 上股骨近段紅骨髓面積百分比可作為重型地中海貧血骨髓移植病情分類的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素.

眾所周知，人出生后造血細(xì)胞主要存在于紅骨髓中，紅骨髓是主要的造血器官，因此用地貧患者的HSCs 狀態(tài)和功能評(píng)價(jià)其骨髓移植的危險(xiǎn)等級(jí)顯得更直接、更客觀. 隨著流式細(xì)胞技術(shù)的快速發(fā)展、HSCs 表面抗原的不斷揭示及其抗體的應(yīng)用，地貧患者骨髓或外周血中的HSCs 研究已可實(shí)現(xiàn).因此，對(duì)不同地貧患者預(yù)處理前HSCs 的狀態(tài)和功能進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)與現(xiàn)有的地貧移植危險(xiǎn)因素和危險(xiǎn)分級(jí)比對(duì)分析，提出一種用地貧患者HSCs 狀態(tài)及功能來(lái)評(píng)價(jià)其骨髓移植危險(xiǎn)因素和等級(jí)的方法，客觀、方便地指導(dǎo)地貧骨髓移植是未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì).

廣東地區(qū)β－地貧基因攜帶率為2.54%［17］，約有患者3 000 人.在中國(guó)，1 名重型地中海貧血患者，如果接受正規(guī)輸血及去鐵治療，每年的費(fèi)用在5 萬(wàn)元以上［18］.開(kāi)展地中海貧血骨髓移植中HSCs 狀態(tài)及功能的研究，直接、客觀地評(píng)價(jià)地貧骨髓移植的危險(xiǎn)因素和危險(xiǎn)分級(jí)，實(shí)時(shí)了解異常HSCs 的根除情況，為現(xiàn)有骨髓移植預(yù)處理方案的調(diào)整提供科學(xué)指導(dǎo)，最終可提高臨床骨髓移植治療地貧的成功率.

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