酵母菌單糖轉(zhuǎn)運蛋白的研究進展

于佳動，蔡靜平，王欽宏

（1.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308）

0 引言

酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白是一類位于細胞質(zhì)膜的重要跨膜蛋白，負責將胞外的糖類轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)供細胞代謝利用，在促進單糖的吸收、代謝方面具有重要的生物學功能[1].近年來，人們在研究以酵母菌作為轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素水解液的菌種生產(chǎn)燃料乙醇等高附加值生物基產(chǎn)品過程中，發(fā)現(xiàn)單糖轉(zhuǎn)運蛋白可顯著提高木質(zhì)纖維素水解液轉(zhuǎn)化乙醇的速率，改善生物轉(zhuǎn)化利用度，因而對該蛋白的深入研究被廣泛關(guān)注，成為目前該類糖轉(zhuǎn)化利用的關(guān)鍵問題[2].

糖的代謝是從胞外轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)開始的，對于細胞糖轉(zhuǎn)運的研究主要集中在己糖轉(zhuǎn)運的生理生化性質(zhì)方面，而在糖由胞外進入胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運如何影響糖的代謝利用研究相對較少.研究表明糖轉(zhuǎn)運能力的差異可改變酵母菌的生長和代謝速率，進而限制了代謝終端產(chǎn)物濃度的提高，因此，糖轉(zhuǎn)運是糖代謝利用的限速步驟之一[3].隨著研究手段的進步，尤其是微生物基因組學及分子生物學技術(shù)的發(fā)展，一些具有天然利用五碳糖能力的酵母陸續(xù)完成基因組解析[4]，使得研究酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白從釀酒酵母逐漸擴展到其他多種酵母，特別是一些能夠利用天然木糖的酵母更是成為研究的重點.

1 酵母菌單糖轉(zhuǎn)運蛋白的研究方法和分類系統(tǒng)

從基因組出發(fā)探究酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白序列信息是最直接、最有效率的研究手段.通過對不同酵母cDNA文庫序列及基因組信息的收集，與已知菌種的單糖轉(zhuǎn)運蛋白序列比對，可以挖掘出新菌種可能具有單糖轉(zhuǎn)運蛋白性質(zhì)的序列，再通過功能互補實驗即可能揭示新菌種單糖轉(zhuǎn)運蛋白的性質(zhì).例如，研究和應(yīng)用較多的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[5]、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)[6]和樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)等菌種在利用己糖和五碳糖上顯示出不同的特性，人們對它們的糖轉(zhuǎn)運蛋白均有較充分的研究.研究者通常以這些已知菌種為依據(jù)，利用GenBank上公布的各種酵母菌的基因組序列，挖掘?qū)Σ煌瑔翁堑孜镛D(zhuǎn)運偏好性高的單糖轉(zhuǎn)運蛋白.進一步將這些新發(fā)現(xiàn)的酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白進行基因、蛋白質(zhì)序列的比對、系統(tǒng)進化樹的分析，即可將它們歸屬于協(xié)助轉(zhuǎn)運擴散超家族（Major facilitator superfamily,MFS）[7]，從而不斷豐富酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白比對源.

酵母中負責糖轉(zhuǎn)運的蛋白種類繁多.研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母6 000多個基因中，編碼糖轉(zhuǎn)運蛋白的基因有35個，其他酵母菌也具有相同的特性.為了方便對已知糖轉(zhuǎn)運蛋白的查找和研究、利用，國外研究者建立了一個專門收錄轉(zhuǎn)運蛋白序列信息的數(shù)據(jù)庫——轉(zhuǎn)運蛋白分類系統(tǒng)（The Transporter Classification，TC）[8]，該系統(tǒng)將不同來源的糖轉(zhuǎn)運蛋白以序列同源性、宿主和功能為依據(jù)進行了分類，共分為兩大超家族，除酵母糖轉(zhuǎn)運蛋白屬于MFS超家族外，另一類為腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族（ATP-binding cassette transporter superfamily，ABC transporter superfamily），細菌糖轉(zhuǎn)運蛋白一般屬于此類超家族[9].

在TC轉(zhuǎn)運蛋白分類系統(tǒng)中，MFS超家族又被分為17個不同的家族，最大的是糖轉(zhuǎn)運蛋白家族（Sugar Porter Family）編號為TC#2.A.1.1.與工業(yè)發(fā)酵、釀酒工業(yè)、木質(zhì)纖維素水解液利用相關(guān)的釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運蛋白家族（HXT）、粟酒裂殖酵母高特異性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族（Ght）、樹干畢赤酵母糖轉(zhuǎn)運蛋白家族(SUT1-3)等均收錄其中.

另有一個專門針對酵母糖轉(zhuǎn)運蛋白的數(shù)據(jù)庫——酵母轉(zhuǎn)運蛋白數(shù)據(jù)庫（Yeast Transporter Protein Database）,可以對酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白進行功能注釋結(jié)果進行分類或預測其功能.根據(jù)轉(zhuǎn)運蛋白數(shù)據(jù)庫收錄的信息，以同源性為依據(jù)去尋找其他酵母中新的單糖轉(zhuǎn)運蛋白序列，不斷發(fā)現(xiàn)新的高效單糖轉(zhuǎn)運蛋白.

2 酵母菌單糖轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象決定蛋白質(zhì)的功能.具有相同空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)在氨基酸組成、功能方面均具有一定的共性.對酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白保守性分析也印證了上述觀點[10-11].對酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白空間結(jié)構(gòu)的分析有助于了解其轉(zhuǎn)運單糖的生物學功能，同時，通過分析結(jié)構(gòu)，聯(lián)系功能信息也可為轉(zhuǎn)運機理的揭示和結(jié)構(gòu)功能的改造奠定基礎(chǔ).

人們在研究轉(zhuǎn)運蛋白時發(fā)現(xiàn)，酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白通常由400～600個氨基酸殘基組成，N端和C端都在細胞質(zhì)的一側(cè).MFS超家族糖轉(zhuǎn)運蛋白的二級結(jié)構(gòu)一般是由12個跨膜疏水α螺旋組成的，在有些酵母中也發(fā)現(xiàn)含有6個、14個或24個的疏水跨膜螺旋[12].含14個跨膜螺旋的轉(zhuǎn)運蛋白是由兩個位于胞內(nèi)中間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)α螺旋插入到細胞膜中形成的，而含有24個疏水跨膜螺旋結(jié)構(gòu)可能是由于早期進化過程中形成了二聚體.但是，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)運蛋白在螺旋數(shù)量上的差異并不影響糖轉(zhuǎn)運蛋白的功能[13].

由于MFS超家族蛋白屬于膜蛋白，在與膜分離純化過程中存在一定難度，三級結(jié)構(gòu)解析方面的研究還很少，第一個高分辨率的三級結(jié)構(gòu)直到2003年才被純化出來，是由Abramson等[14]解析出負責乳糖轉(zhuǎn)運的乳糖透過酶（LacY）蛋白的三級結(jié)構(gòu).2012年，清華大學的顏寧研究小組通過對大腸桿菌中負責轉(zhuǎn)運木糖的XylE轉(zhuǎn)運蛋白晶體結(jié)構(gòu)的分析，也呈現(xiàn)出典型的MFS超家族折疊方式[15].MFS超家族的12個跨膜α螺旋分成兩個亞基，呈現(xiàn)出一種向細胞外側(cè)開放接收糖類、部分封閉的構(gòu)象.基于MFS超家族在結(jié)構(gòu)和功能上表現(xiàn)出的共性，根據(jù)氨基酸序列模擬酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)，均表現(xiàn)出MFS超家族的特征[16].但是，迄今為止還未見有高分辨率酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白晶體的報道.

3 酵母菌單糖轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運機制及表達調(diào)控

酵母菌單糖轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運過程及其機制是人們一直非常關(guān)注的重點之一，目前已經(jīng)從分子水平揭示了糖從被轉(zhuǎn)運蛋白識別、結(jié)合、至釋放的整個動態(tài)過程.在轉(zhuǎn)運蛋白MFS超家族中，酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白依靠兩種方式進行轉(zhuǎn)運，一種是依靠胞內(nèi)外濃度梯度進行促進擴散（Facilitated diffusion），另一類則是依靠質(zhì)子動力的H+協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白（H+Symporter transporter） 或 Na+協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白 （Na+Symporter transporter）[17]來實現(xiàn)轉(zhuǎn)運過程.

那七八個男人每人一棍，有揍他背的，有揍他胸的，有揍他腰的，有揍他腿……癩阿小一下挨了七八棍，就像一條死狗那樣賴在地上，哭啊喊啊叫啊……當然不忘向他們求饒，最后輪到白天明，他接過木棍，對癩阿小說：“我去年就想揍你了，你個畜生賊性不改，今年我可得讓你長點記性了。”白天明奮力一棍下去，嚓！只聽得癩阿小一聲慘叫，他的右腿斷了。

酵母菌單糖轉(zhuǎn)運首先涉及底物識別和釋放的過程，Jardetzk等[18]提出了“交替通路”的機制，認為在糖轉(zhuǎn)運過程中，單糖轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，整個過程不涉及到底物位點的變化，只涉及蛋白構(gòu)象的變化，使底物結(jié)合位點交替開口于膜內(nèi)外兩側(cè)，交替變化，最終完成糖的轉(zhuǎn)運.Smirnova等[19]通過對單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因lacY的研究，提出了搖桿理論，該理論也與底物結(jié)合后引起轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)象變化有關(guān)，認為轉(zhuǎn)運蛋白以底物結(jié)合部位為軸進行轉(zhuǎn)動，將糖類轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，轉(zhuǎn)運蛋白的開口方向也發(fā)生了變化，由最初的向外開口變成向內(nèi)開口，這種理論后來又得到Kaback實驗室通過雙電子共振實驗[20]、氨基酸熒光實驗[21]、定向烷化實驗[22]等生化實驗證明.

糖轉(zhuǎn)運蛋白的構(gòu)象改變也與自身氨基酸殘基參與質(zhì)子的結(jié)合、傳遞、釋放的過程有關(guān).Kilian、Gardonyi等[23-24]在對可以轉(zhuǎn)運木糖的間型假絲酵母和樹干畢赤酵母中發(fā)現(xiàn)了Na+或H+結(jié)合的單糖:質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運蛋白，因細胞具有保K+排Na+性質(zhì)，細胞膜外Na+的濃度較高，即Na+的電化學梯度流向膜內(nèi)，葡萄糖依靠Na+梯度所提供的能量，通過糖轉(zhuǎn)運蛋白，與Na+一起轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，葡萄糖運輸?shù)乃俣扰c胞外Na+濃度成正比，隨后Na+經(jīng)細胞膜上回路又泵回胞外，H+由于呼吸作用產(chǎn)生的電子傳遞形成膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度產(chǎn)生流向胞內(nèi)的力參與葡萄糖的協(xié)同轉(zhuǎn)運.

研究者也從分子遺傳學的角度研究酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白的作用機制，他們通過分析編碼轉(zhuǎn)運蛋白基因在整個糖代謝過程中扮演的角色，揭示其調(diào)控的功能，闡明轉(zhuǎn)運蛋白的作用機制.例如，釀酒酵母體內(nèi)含有18個己糖轉(zhuǎn)運蛋白（HXT1～HXT17、Gal2） 和兩個葡萄糖傳感蛋白（Rgt1p、Snf2p）[25]，用敲除掉hxt1-hxt7基因的釀酒酵母菌進 行 功 能 互 補 實 驗 證 明 HXT1～HXT4、HXT6、HXT7、Gal2為釀酒酵母體內(nèi)主要負責轉(zhuǎn)運葡萄糖的轉(zhuǎn)運蛋白[3,26]，用敲除掉 hxt1～hxt17、gal2基因的釀酒酵母對 HXT8～HXT11、HXT13～HXT17 的功能驗證，利用葡萄糖生長并不明顯，hxt12基因被插入序列阻斷，因此失去了轉(zhuǎn)運糖的功能.部分己糖轉(zhuǎn)運蛋白在釀酒酵母染色體中的位置也已確定，hxt1、hxt4、hxt5的位置是在染色體Ⅲ上[27].HXT6、HXT7蛋白序列僅有兩個氨基酸的差異，它們的基因串聯(lián)在一起，與hxt3基因的3′末端相鄰，位于染色體Ⅵ上[28].

酵母菌單糖轉(zhuǎn)運蛋白受基質(zhì)中葡萄糖濃度的調(diào)控，Johnston等[28]根據(jù)hxt1～hxt4基因在不同葡萄糖濃度下表達量的不同，揭示了它們在基質(zhì)中不存在葡萄糖、低濃度葡萄糖和高濃度葡萄糖情況下單糖轉(zhuǎn)運蛋白的誘導表達機制.發(fā)現(xiàn)有許多蛋白質(zhì)，如葡萄糖阻遏因子Rgt1、Mig1，葡萄糖誘導因子Snf1、Grr1等參與了hxt1～hxt4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.Rgt1是一種結(jié)合在hxt1～hxt4基因前啟動子區(qū)的阻遏物，當基質(zhì)中不存在葡萄糖時，Rgt1抑制hxt1～hxt4基因的表達.hxt3基因的轉(zhuǎn)錄與葡萄糖的濃度無關(guān)，只通過Rgt1的活性來進行調(diào)節(jié).hxt2、hxt4基因的轉(zhuǎn)錄在無葡萄糖的情況下也受到Rgt1的阻遏，在高濃度葡萄糖中受到另一種阻遏物Mig1的阻遏，只有在低濃度的葡萄糖中，hxt2、hxt4基因才能最大限度的表達.HXT1在高濃度條件下才能表達，Rgt1在高濃度葡萄糖條件下阻遏HXT1啟動子的轉(zhuǎn)錄，必須啟動另一條信號通路才能啟動HXT1的表達，Reg1活化Act，啟動HXT1啟動子的轉(zhuǎn)錄.

RenVerwace[29]在對酵母菌hxt5基因的研究中發(fā)現(xiàn)，HXT5的表達不依賴葡萄糖濃度，而是由細胞生長的速度決定，當細胞低速生長時，hxt5基因的轉(zhuǎn)錄量增大，在細胞延遲期、穩(wěn)定期主要負責糖的轉(zhuǎn)運.此外，氧氣也是調(diào)控單糖轉(zhuǎn)運蛋白的重要因子[30-31]，樹干畢赤酵母sut1～sut3基因的表達受氧的調(diào)控，在通氧情況下，才可以表達.因此，不同酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運分子機制是不同的，既由基質(zhì)中葡萄糖濃度決定，也受氧濃度的調(diào)控來啟動不同單糖轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)錄、表達.

4 酵母菌單糖轉(zhuǎn)運蛋白的分子改造與應(yīng)用

在發(fā)酵條件下，細胞面臨的環(huán)境不是一成不變的，要根據(jù)發(fā)酵具體要求選用穩(wěn)定、高效且適應(yīng)不同單糖底物的轉(zhuǎn)運蛋白.因此，需要從實際應(yīng)用的角度對單糖轉(zhuǎn)運蛋白進行篩選、評價和改造.除利用葡萄糖發(fā)酵外，還有在釀酒工業(yè)中應(yīng)用的果糖發(fā)酵，在食品添加劑生產(chǎn)中的應(yīng)用木糖發(fā)酵等.目前在國內(nèi)外最受關(guān)注的是木質(zhì)纖維素水解液的發(fā)酵，因為木質(zhì)纖維素的主要成分為纖維素和半纖維素，水解液中含有不同的單糖成分，包括葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖和少量阿拉伯糖，由于基質(zhì)由混合的不同種類單糖組成，要提高糖的綜合利用率，對轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控提出了更高的要求.

現(xiàn)有的研究和應(yīng)用證明，樹干畢赤酵母、間型假絲酵母、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)等可以利用木質(zhì)纖維素水解液進行發(fā)酵[2,32].樹干畢赤酵母是目前公認發(fā)酵木糖最好的菌株之一，其單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因sut1～sut3已被克隆出來，SUT1～SUT3在2%木糖濃度環(huán)境下轉(zhuǎn)運木糖的Km值約為20 mmol/L[31].從間型假絲酵母中克隆出的gxf1和gxs1是近年來人們研究最多的可以轉(zhuǎn)運木糖的轉(zhuǎn)運蛋白基因，已經(jīng)被應(yīng)用到酵母工程菌的構(gòu)建，證明可以有效提高木糖的轉(zhuǎn)化效率[33].在研究Candida succiphila和Kluyveromyces marxianus兩個菌種提高木糖發(fā)酵效率的試驗中，Stambuk等[34]發(fā)現(xiàn)兩個低親和性的木糖轉(zhuǎn)運蛋白.在制作面包中經(jīng)常使用的得巴利漢遜酵母（Debaryomyces hansenii）單糖轉(zhuǎn)運蛋白XylHP也被證明具有木糖轉(zhuǎn)運的能力[35]，但在酵母菌中，目前還沒有發(fā)現(xiàn)可特異轉(zhuǎn)運木糖的轉(zhuǎn)運蛋白.

在酵母對木糖的轉(zhuǎn)運環(huán)節(jié)中，目前的研究主要集中在對可利用木糖發(fā)酵酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白功能的評價.Hamacher等[36]在釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運蛋白功能互補試驗中，發(fā)現(xiàn) HXT4、HXT5、HXT7、Gal2 均可轉(zhuǎn)運2%的木糖.本實驗室的一株麥芽糖假絲酵母（Candida maltosa Xu316）可以高效利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇，轉(zhuǎn)化率達到0.85g/g，是木質(zhì)纖維素水解液利用及混合糖發(fā)酵中應(yīng)用價值較高的菌種.對其基因組基因進行預測、注釋分析發(fā)現(xiàn)了23個假定的糖轉(zhuǎn)運蛋白中，通過功能互補實驗已驗證出5個單糖轉(zhuǎn)運蛋白分別在2%葡萄糖、木糖濃度下發(fā)揮糖轉(zhuǎn)運功能（結(jié)果待發(fā)表）.

酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白不僅表現(xiàn)出對葡萄糖、木糖的親和性，果糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖也可作為不同單糖轉(zhuǎn)運蛋白的底物.釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運蛋白HXT1～HXT7可以轉(zhuǎn)運果糖及甘露糖.Cason等在對S.pastorianus和S.bayanus發(fā)現(xiàn)了高親和性果糖轉(zhuǎn)運蛋白[37].樹干畢赤酵母SUT1、SUT3可轉(zhuǎn)運果糖，SUT3也可以轉(zhuǎn)運半乳糖[31].Young等[38]對26種不同酵母來源的單糖轉(zhuǎn)運蛋白進行了6種底物（葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、果糖、核糖）轉(zhuǎn)運能力的測試，有10種轉(zhuǎn)運蛋白至少可以利用一種單糖，通過序列比對，鑒定出樹干畢赤酵母菌xut基因、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)和得巴利漢遜酵母菌的轉(zhuǎn)運蛋白ORF.對阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運研究中，釀酒酵母可轉(zhuǎn)運半乳糖的轉(zhuǎn)運蛋白Gal2證明也可以轉(zhuǎn)運阿拉伯糖[39-40]，在樹干畢赤酵母中，新發(fā)現(xiàn)了可以轉(zhuǎn)運阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運蛋白AraT，與釀酒酵母菌己糖轉(zhuǎn)運蛋白Gal2相比，在阿拉伯糖（2%）消耗速率和菌體比生長速率上均比Gal2要低，但在低濃度阿拉伯糖（0.5%）情況下，AraT的轉(zhuǎn)運效率要比Gal2高，這也印證了單糖轉(zhuǎn)運蛋白具有自身獨特的性質(zhì)，外界糖濃度的高低啟動不同單糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達.由此可以看出，酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白并非具有嚴格的底物特異性，與其結(jié)構(gòu)相似的單糖均可以被轉(zhuǎn)運，只是底物的親和力大小不同，反映出轉(zhuǎn)運速率的差異，要根據(jù)實際應(yīng)用選擇與底物親和力高的單糖轉(zhuǎn)運蛋白.

影響單糖轉(zhuǎn)運蛋白與糖親和力的因素均為復雜.研究發(fā)現(xiàn)，酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白中的12個疏水跨膜螺旋中的 3、5、7、8、11 與底物的結(jié)合有關(guān)，一些芳香族氨基酸的殘基與葡萄糖或木糖結(jié)合.對MFS超家族基因GLUT1的研究中發(fā)現(xiàn)了一些影響轉(zhuǎn)運蛋白功能的活性位點，但還沒有發(fā)現(xiàn)一個氨基酸殘基的突變直接會給葡萄糖結(jié)合帶來嚴重影響的位點.通過定點突變的實驗發(fā)現(xiàn)，Asn34、Ser66、Thr295、Thr310在胞外與結(jié)合糖的能力相關(guān).突變第2和第4跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基（Gly75、Gly130），發(fā)現(xiàn)突變后的糖轉(zhuǎn)運蛋白的底物結(jié)合空間不協(xié)調(diào)，影響了糖的結(jié)合.

對釀酒酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白H XT2和Gal2的研究中發(fā)現(xiàn)，C末端由101個氨基酸組成的區(qū)域起到對不同底物——葡萄糖、半乳糖的識別作用[10]，Kasahara將hxt2和gal2基因決定第10個疏水跨膜螺旋的12個氨基酸隨機突變，得到25 000種組合在含有半乳糖的平板中進行功能驗證，發(fā)現(xiàn)芳香族氨基酸殘基（Tyr446、Trp455）與底物的結(jié)合有關(guān)，將此殘基用另19種必需氨基酸取代，Gal2轉(zhuǎn)運半乳糖的活性只有突變前的20%，有的喪失了轉(zhuǎn)運半乳糖的能力.釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運蛋白Hxt2的研究也發(fā)現(xiàn)了影響底物識別的殘基，位于蛋白質(zhì)氨基酸431處，不同的氨基酸也會給底物的識別帶來明顯的影響.

從上述研究結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，糖和轉(zhuǎn)運蛋白相互作用是依靠一定的殘基（芳香族氨基酸）之間的氫鍵形成一定的空間結(jié)構(gòu)來維持的，以達到最佳的底物與轉(zhuǎn)運蛋白的構(gòu)象效果，這與酶的基本特性相似.近年來，為了提高木質(zhì)纖維素水解液中單糖的轉(zhuǎn)化效率，尤其是木糖的轉(zhuǎn)化效率，對糖轉(zhuǎn)運蛋白進行了一些改造，提高其對底物的親和力.例如，采用定點突變的方法對樹干畢赤酵母菌sut3基因和間型假絲酵母菌gxs1基因進行位點突變，SUT3、GXS1突變株在低濃度的葡萄糖和木糖中的生長能力相同，相比突變前提高了對木糖的利用效率[38]；Guillaume等[41]在研究提高釀酒酵母利用葡萄糖、果糖的轉(zhuǎn)化效率中，對己糖轉(zhuǎn)運蛋白HXT3在結(jié)構(gòu)預測基礎(chǔ)上，進行了10個位點的突變，突變后的HXT3蛋白顯著提高了利用果糖發(fā)酵的能力.因此，改變單糖轉(zhuǎn)運蛋白的底物結(jié)合位點，可有效促進單糖轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合不同單糖的能力，這種基因工程手段已經(jīng)成為目前單糖轉(zhuǎn)運蛋白應(yīng)用研究的熱點.

5 展望

木質(zhì)纖維素來源廣泛，若能被充分利用，最有希望取代糧食和煤炭能源，成為生產(chǎn)生物基能源產(chǎn)品的主要原料.當前利用木質(zhì)纖維素的瓶頸是水解液的轉(zhuǎn)化效率低的問題，通過研究單糖轉(zhuǎn)運蛋白可有效提高底物單糖的利用速率，進而增加生物基產(chǎn)品的生產(chǎn)效率，這一木質(zhì)纖維素利用的攻克手段已受到越來越多研究者的重視.隨著新的單糖轉(zhuǎn)運蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)，對其后續(xù)的研究，如功能驗證、結(jié)構(gòu)解析、機理研究將顯得尤為重要.因此，需要從分子生物學角度進一步深入研究單糖轉(zhuǎn)運蛋白與底物結(jié)合的關(guān)系，尤其要通過對酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白關(guān)鍵氨基酸殘基位點的分析，實現(xiàn)對單糖轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，從而有效提高底物與轉(zhuǎn)運蛋白之間的親和度；與此同時，還應(yīng)當提高單糖轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，及在不同糖濃度下的轉(zhuǎn)運活性，以適應(yīng)復雜多變的發(fā)酵環(huán)境.

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