納米羥基磷灰石在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)展

郭國財(cái)，王 超，姚維成

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266000)

納米羥基磷灰石(nHAP)是一種優(yōu)質(zhì)的醫(yī)用生物材料，除具有羥基磷灰石(HAP)良好的生物活性及組織相容性外，還有其特性，特別是廣譜的抗癌作用。人腦膠質(zhì)瘤是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，病死率、復(fù)發(fā)率高。本文綜述nHAP在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 膠質(zhì)瘤的現(xiàn)狀

膠質(zhì)瘤預(yù)后差，近年來發(fā)病率有上升的趨勢(shì)。有資料顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤經(jīng)確診后1年生存率為30%左右，平均生存期53周左右，手術(shù)及放化療后，平均生存期也僅為 14．6 個(gè)月左右［1，2］。目前，惡性腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是手術(shù)爭取全切后輔以放療和化療。惡性腦膠質(zhì)瘤因其浸潤彌漫性生長，或位置深在，或累及重要功能區(qū)，往往不能被完全切除。而且，由于多數(shù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的基因特性和血腦屏障(BBB)的存在，使放療和化療效果差。近年來，大量的輔助治療方法如基因治療、免疫治療及靶向治療等被應(yīng)用，并且取得了一定的療效。

2 nHAP的性質(zhì)

HAP是一種含有氫氧化物離子的磷酸鈣鹽，是人體骨、牙齒無機(jī)物的主要成分。HAP與人體骨骼晶體結(jié)構(gòu)基本一致，為六方晶系，呈弱堿性，微溶于水，易溶于酸，難溶于堿。HAP是一種強(qiáng)離子交換劑，分子中的鈣離子容易被鎘、汞、鍶、鋇等金屬離子置換，還可與含有羧基的氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等發(fā)生反應(yīng)。HAP的許多特性與其粒徑大小和晶體形態(tài)密切相關(guān)。

nHAP表現(xiàn)出更優(yōu)越的性能。nHAP具有溶解度高、均勻分散良好、吸附性強(qiáng)和生物親和性等特質(zhì)，有更好的生物活性、組織相容性和化學(xué)穩(wěn)定性。大量的生物相容性研究已證實(shí)，nHAP無毒、無刺激、不導(dǎo)致過敏反應(yīng)、不導(dǎo)致溶血、不導(dǎo)致突變、不破壞生物組織，能與骨形成牢固的化學(xué)結(jié)合，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用生物材料領(lǐng)域，如硬組織修復(fù)材料、藥物及基因載體等。

3 nHAP的抗腫瘤作用機(jī)制

Sun等［3］采用液相沉淀法合成nHAP微晶作為抗癌藥物載體，在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中意外發(fā)現(xiàn)，nHAP微晶明顯抑制Ca-9癌細(xì)胞的增殖，而且，他們還發(fā)現(xiàn)nHAP微晶體能夠吸附阿霉素(ADM)、氟尿嘧啶(5-FU)、絲裂霉素C(MMC)等抗腫瘤藥物，作為它們的載體，而ADM和載有ADM的HAP(ADMHAP)對(duì)癌細(xì)胞均有抑制作用，且后者明顯優(yōu)于前者［4］。多項(xiàng)研究［5～8］已證實(shí)，nHAP 能夠抑制人白血病、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、肝癌等多種癌細(xì)胞的增殖。目前，研究發(fā)現(xiàn)nHAP抗腫瘤作用的機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面。

3．1 nHAP作為化療藥物、基因治療的載體nHAP顆粒小、無毒、無免疫原性、有良好的組織相容性、生物黏附性強(qiáng)，可吸附藥物量大并且能結(jié)合、運(yùn)載大分子藥物，可對(duì)插入其中的DNA片斷有很好的保護(hù)作用，是一種良好的藥物或基因載體，能夠攜帶抗腫瘤藥物或放射性元素殺滅腫瘤細(xì)胞。Itokazu等［9］報(bào)道，ADM-HAP作用于骨肉瘤細(xì)胞效果較好，ADM緩慢釋出可顯著延長藥物作用時(shí)間，能更有效地抑制癌細(xì)胞增殖。nHAP可將蛋白類藥物或DNA、RNA等基因治療分子包裹或吸附在其表面，同時(shí)也可在顆粒表面偶聯(lián)特異性的靶向分子，比如特異性配體、單克隆抗體等，通過靶向分子與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，經(jīng)細(xì)胞吞飲進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向藥物治療或基因治療［10］。

3．2 nHAP作用于細(xì)胞膜 正常狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)Ca2+維持在低水平，腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞有更強(qiáng)的鈣攝入能力。nHAP作用于細(xì)胞膜，可導(dǎo)致過多的Ca2+攝入，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，使細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，激活細(xì)胞內(nèi)的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶，使 DNA 降解、細(xì)胞凋亡［11］。

3．3 nHAP作用于細(xì)胞內(nèi)溶酶體 腫瘤細(xì)胞較正常組織細(xì)胞有更高的吞噬活性。nHAP溶膠易被吞噬進(jìn)入細(xì)胞，與初級(jí)溶酶體結(jié)合形成次級(jí)溶酶體，在其內(nèi)降解產(chǎn)生游離酸或者其他細(xì)胞毒性產(chǎn)物，導(dǎo)致溶酶體破裂及酶的釋放，從而啟動(dòng)溶酶體的凋亡途徑，抑制腫瘤生長或直接破壞細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、破裂、死亡［12］。

3．4 nHAP影響核酸合成 張建平等［13］采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，檢測(cè)nHAP對(duì)大鼠乳腺癌細(xì)胞系Walker256的 DNA損傷作用，發(fā)現(xiàn) nHAP可導(dǎo)致DNA鏈形成缺口，阻礙核酸合成，并且作用強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)。

3．5 nHAP誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯與凋亡 研究發(fā)現(xiàn)，nHAP可能抑制微管、微絲的形成，使癌細(xì)胞分化受阻于G2期，并推測(cè)，假如nHAP與G2期時(shí)相敏感抗癌藥合用，會(huì)有化療增敏作用［14］。p53、p21、c-myc等基因和Caspase等是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要基因，它們控制細(xì)胞DNA損傷的應(yīng)答時(shí)序，協(xié)調(diào)應(yīng)答過程，通過調(diào)節(jié)DNA復(fù)制、阻斷細(xì)胞周期或促進(jìn)細(xì)胞凋亡等程序，引起諸多相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［15］。p53是一類重要的抑癌基因，主要在G1/S期起控制點(diǎn)作用，它決定細(xì)胞是否啟動(dòng)DNA合成。p53蛋白可上調(diào)p21(細(xì)胞周期依賴的蛋白激酶抑制劑)表達(dá)，阻止細(xì)胞分裂，并給細(xì)胞提供足夠的時(shí)間來修復(fù)損傷。c-myc是另一個(gè)使細(xì)胞由G1期向S期過渡的必要的早期應(yīng)答基因。研究發(fā)現(xiàn)［7］，nHAP能夠上調(diào)p53表達(dá)，下調(diào)c-myc表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G1期。

3．6 nHAP影響端粒酶的活性 端粒酶活性表達(dá)是諸多惡性腫瘤獲得無限制生長能力中很重要的環(huán)節(jié)。端粒酶的主要功能是維持染色體末端的端粒序列，維持染色體的穩(wěn)定性，抵消因細(xì)胞分裂所致的端粒DNA損耗，起到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。nHAP有抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶基因表達(dá)和下調(diào)端粒酶活性的作用［16］。

4 nHAP對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療作用

目前，腦膠質(zhì)瘤的主要治療方法是手術(shù)切除，輔以放化療。但是，腦膠質(zhì)瘤的基因特性決定了其對(duì)放射治療不敏感。而且，血腦屏障(BBB)使絕大多數(shù)小分子化合物和幾乎所有的大分子物質(zhì)不能進(jìn)入腦病變區(qū)，也削弱了化療藥物對(duì)腦膠質(zhì)瘤的療效。

納米粒子轉(zhuǎn)運(yùn)藥物不需要開放BBB，允許幾乎所有的藥物被轉(zhuǎn)運(yùn)入腦細(xì)胞內(nèi)，且不需要對(duì)藥物本身進(jìn)行修飾;另外，還可用納米控釋系統(tǒng)使藥物緩慢的釋放，維持長時(shí)間腦血管藥物濃度，提高療效。沈維高等［17］將負(fù)載Stat3 shRNA的nHAP作用于鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其顯著抑制腫癌生長。因此，推測(cè)nHAP有望成為腦膠質(zhì)瘤基因、化學(xué)藥物治療的良好載體。

nHAP 本身具有廣譜抗癌作用。田昂等［18，19］應(yīng)用電化學(xué)沉積法在鈦合金表面制備nHAP涂層，與人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)nHAP涂層能夠很好地抑制U87細(xì)胞的增殖，證實(shí)了nHAP對(duì)膠質(zhì)瘤具有抑制作用，并且nHAP的不同形態(tài)對(duì)U87細(xì)胞增殖有不同的抑制作用，其中針狀結(jié)構(gòu)抑制作用最強(qiáng)。

研究證實(shí)，nHAP只能與TLR+4的單核細(xì)胞相互作用。Toll樣受體(TLRs)為Ⅰ型跨膜受體，用來識(shí)別和傳導(dǎo)先天性和適應(yīng)性的免疫反應(yīng)信號(hào)，通過以核因子-κB(NF-κB)為主的刺激信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路，激活多種靶基因，導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放和協(xié)同刺激因子的表達(dá)。膠質(zhì)瘤是起源于膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中行使單核細(xì)胞的功能。膠質(zhì)瘤細(xì)胞本身可以表達(dá)TLRs［19］，這為nHAP作用于膠質(zhì)瘤并通過TLRs進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)提供了理論依據(jù)，其機(jī)制可能涉及TLR4受體的調(diào)控表達(dá)［19］。

TLR4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的炎性受體，能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(JNK)/應(yīng)急激活蛋白激酶(SAPK)兩條途徑激活炎性細(xì)胞，導(dǎo)致炎性因子TNF-α、IL-6等的大量表達(dá)，觸發(fā)一系列的炎性反應(yīng)，可對(duì)腫瘤細(xì)胞起到抑制作用。Grandjean-Laquerriere等研究發(fā)現(xiàn)，nHAP可以誘導(dǎo) TNF-α、IL-6、IL-10和 IL-18的高表達(dá)，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、IL-1b的高表達(dá)。但nHAP與膠質(zhì)瘤細(xì)胞TLRs的相互作用及信號(hào)傳導(dǎo)途徑還有待進(jìn)一步研究。

5 nHAP的生物安全性及存在的問題

nHAP具有很好的生物活性和生物相容性，并且能與骨形成緊密的化學(xué)結(jié)合，作為人工骨材料和組織材料已得到廣泛應(yīng)用。

郭曉東等通過Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)、急性和亞急性毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和凝血試驗(yàn)，證明nHAP/PDLLA材料沒有毒性，無致突變性和刺激性，不會(huì)引起溶血和凝血。劉麗萍等給家兔靜脈注射nHAP，發(fā)現(xiàn)致死劑量或接近致死劑量的nHAP，對(duì)動(dòng)物的肝腎功能及酶的影響是一過性的，各項(xiàng)功能均在很短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)正常，無明顯毒性蓄積。但是，研究發(fā)現(xiàn)，nHAP顆粒所組成的溶膠具有一定的不穩(wěn)定性，隨著存放時(shí)間的延長及膠體濃度的增加，nHAP顆粒會(huì)出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，使顆粒體積增大，甚至超出納米級(jí)的范圍。當(dāng)nHAP顆粒超過毛細(xì)血管內(nèi)徑范圍時(shí)，將產(chǎn)生嚴(yán)重后果，如果廣泛栓塞肺毛細(xì)血管網(wǎng)，導(dǎo)致急性呼吸功能衰竭和右心功能衰竭。

nHAP粒子溶膠的血液相容性研究結(jié)果提示，在制備nHAP粒子的時(shí)候，應(yīng)充分考慮粒子的尺寸與分散性可能帶來的生物學(xué)效應(yīng)。另外，nHAP可能會(huì)從復(fù)合材料中游離出來，并在體內(nèi)遷移，對(duì)生物體產(chǎn)生影響;或者某些成分從nHAP中游離出來，導(dǎo)致nHAP的性能改變，對(duì)生物體產(chǎn)生影響。

因此，將nHAP用作靶向藥物載體和抗腫瘤藥物前需要解決以下問題:①nHAP粒子是否容易獲得和均勻分散;②在加載藥物或蛋白質(zhì)等處理過程中，nHAP粒子的粒徑分布是否能穩(wěn)定在100 nm范圍內(nèi);③nHAP粒子不應(yīng)該對(duì)正常人體細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。在考慮nHAP的生物學(xué)應(yīng)用前景時(shí)，除了要考慮nHAP粒子本身的性質(zhì)外，篩選具備生物學(xué)惰性的穩(wěn)定劑、分散劑也是不可忽視的問題。

6 展望

nHAP具有特殊的物理、化學(xué)性質(zhì)及生物特性，表現(xiàn)出良好的骨誘導(dǎo)性及骨結(jié)合性，可以作為藥物載體，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。而且，nHAP具有廣譜抗癌作用，對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖、生長具有抑制作用，但其抗腫瘤機(jī)制尚未研究清楚，特別是信號(hào)傳導(dǎo)及基因調(diào)控等方面。相信隨著研究的不斷深入，對(duì)nHAP性能的了解會(huì)越來越多，其安全性得以充分的評(píng)價(jià)，其用途也將越來越廣泛，定會(huì)為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新的途徑。

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