動(dòng)物源性食品中喹諾酮類藥物殘留量檢測(cè)的研究進(jìn)展

崔常勇 （龍口出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東 龍口 265700） 徐 寧 （山東省龍口市發(fā)展和改革局）

動(dòng)物源性食品中喹諾酮類藥物殘留量檢測(cè)的研究進(jìn)展

崔常勇 （龍口出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東 龍口 265700） 徐 寧 （山東省龍口市發(fā)展和改革局）

喹諾酮類藥物是一類人工合成的能作用于細(xì)菌的DNA而造成不可逆損害的抗生素，因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無(wú)交叉耐藥性和毒副作用小等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物的治療，因此也對(duì)食品安全和社會(huì)公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)，概括總結(jié)了該類藥物的理化檢測(cè)法、微生物檢測(cè)法和免疫分析法等主要檢測(cè)方法，旨在為今后喹諾酮類殘留物檢測(cè)方法的研究提供一個(gè)重要依據(jù)。

1 理化檢測(cè)法

1.1 高效液相色譜法 高效液相色譜法具有分離度較好、靈敏度高、重現(xiàn)性好、假陽(yáng)性少等優(yōu)點(diǎn)，但前處理過(guò)程復(fù)雜、儀器成本高、回收率偏低，不能對(duì)樣品進(jìn)行完全定性檢測(cè)。

董艷峰等[1]建立了HPLC法測(cè)定雞肝中5種氟喹諾酮類藥物殘留，方法采用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，5種藥物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，平均回收率為70.2%～98.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～12.1%，檢出限和定量限分別為0.02μg/g和0.05μg/g，適用于雞肝中5種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)。趙思俊等[2]采用高效液相色譜法法檢測(cè)雞肉和豬肉中7種喹諾酮類藥物殘留，線性范圍為0.3～100μg/L，線性相關(guān)系數(shù)高于0.9989，平均回收率為70.4%～105.8%，檢測(cè)限為10-8～3×10-8%，能夠滿足檢測(cè)要求。楊守國(guó)等[3]建立了一種高效液相色譜-熒光測(cè)定方法，檢測(cè)養(yǎng)殖海水中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星3種喹諾酮類藥物。結(jié)果表明：以上3種藥物的檢出限分別為2、1和1μg/L，定量限分別為6.6、3.3和3.3μg/L，回收率為71.9%～85.3%，批內(nèi)變異系數(shù)≤10%，批間變異系數(shù)≤7%。

1.2 聯(lián)用技術(shù) 聯(lián)用技術(shù)是利用色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合使用來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)。該技術(shù)結(jié)果較為準(zhǔn)確，能對(duì)樣品進(jìn)行定量和定性檢測(cè)，能滿足進(jìn)出口產(chǎn)品各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)的檢測(cè)，可用于動(dòng)物性產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留的確證檢測(cè)，但有著前處理過(guò)程復(fù)雜、儀器成本高和耗時(shí)比較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。應(yīng)用較多的有液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)，高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLCMS/MS)，液相色譜一熒光法(LC-FD)等。

黃優(yōu)生等[4]建立了快速測(cè)定魚(yú)肉中4種氟喹諾酮類藥物殘留的HPLC-MS/MS方法，該法對(duì)4種藥物的線性范圍為2～40μg/kg，相關(guān)系數(shù)大于0.997，回收率為79.9%～98.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～8.7%，檢出限為0.1～0.4μg/kg，定量限為0.3～1.0μg/kg。Hassouan M K等[5]研究了同時(shí)檢測(cè)豬腎中8種喹諾酮類藥物殘留的LC-FD法，檢測(cè)限為10-7%～8×10-7%。何強(qiáng)等[6]采用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中15種喹諾酮類藥物殘留，用Oasis HLB固相萃取柱凈化，檢出限低于或等于1.0ng/ml，回收率均為78.6%～112.9%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)10%。

1.3 高效毛細(xì)管電泳法 高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)待檢測(cè)樣品中各組分在毛細(xì)管電場(chǎng)中的遷移速度的不同而進(jìn)行分離的一種液相分離技術(shù)。此法分離率高，速度快、操作簡(jiǎn)單、色譜柱不受樣品污染、樣品用量少，但對(duì)檢測(cè)器的要求標(biāo)準(zhǔn)很高，價(jià)格昂貴。作為一種較為有效的分離技術(shù)，高效毛細(xì)管電泳法有著廣闊的應(yīng)用前景。

田晶晶等[7]采用高效毛細(xì)管電泳法分離檢測(cè)加替沙星、洛美沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星和氧氟沙星等5種喹諾酮類藥物。在檢測(cè)波長(zhǎng)為268nm時(shí)，確定最佳試驗(yàn)參數(shù)，此時(shí)5種藥物在9min內(nèi)基線分離，樣品濃度在2×10-6～4×10-6mmol/L之間。此法檢測(cè)市售洛美沙星片中洛美沙星的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%，回收率為109.4%。李日鋒等[8]利用區(qū)帶毛細(xì)管電泳法建立了同時(shí)分離檢測(cè)6種喹諾酮類抗生素。結(jié)果表明：6種藥物在10min內(nèi)完全基線分離，線性關(guān)系大于0.9929，檢出限為29～51μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4%。此外，Matthias F等[9]建立了分離9種喹諾酮類藥物的毛細(xì)管電泳方法，檢測(cè)限低于1μg/L。

2 微生物檢測(cè)法

微生物檢測(cè)法是一種傳統(tǒng)的生物活性測(cè)定方法，是最早被應(yīng)用的檢測(cè)方法。根據(jù)藥物對(duì)微生物的生理機(jī)能和代謝的抑制來(lái)檢測(cè)藥物殘留，此法的優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，適合大規(guī)模的定性篩選，但是結(jié)果易受干擾，耗時(shí)較長(zhǎng)。

陳遷等[10]建立了自動(dòng)化微生物比濁法測(cè)定血清中環(huán)丙沙星的殘留，檢出低限為0.03μg/ml。黃曉蓉等[11]利用微生物檢測(cè)法測(cè)定鰻魚(yú)及其制品中喹諾酮類藥物殘留，回收率為75.89%～83.12%，檢測(cè)限為環(huán)丙沙星2×10-6%，恩諾沙星2.5%，其他喹諾酮類藥物5×10-6%～2.5×10-6%。此外，杜黎明等[12]用管碟法I號(hào)培養(yǎng)基制備雙蝶，以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)菌測(cè)定了血清中氧氟沙星的含量。

3 免疫分析法

免疫分析法是一種以抗原和抗體的特異性、可逆性結(jié)合為基礎(chǔ)的新型技術(shù)，可以定量及半確證檢測(cè)動(dòng)物性產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留，該法操作簡(jiǎn)單、速度快、分析成本低，但是假陽(yáng)性率較高。主要包括酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、熒光免疫分析法(FIA)、酶免疫分析法(EIA)和膠體金免疫測(cè)定法(CGIA)等，下面主要介紹酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)。

酶聯(lián)免疫法是以抗原和抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，結(jié)合酶與底物的特異性反應(yīng)來(lái)放大反應(yīng)靈敏度的分析方法。劉歡歡等[13]采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)雞蛋中喹諾酮類藥物殘留，結(jié)果顯示，在5～50μg/kg濃度添加范圍的平均回收率為70%以上，批內(nèi)變異系數(shù)≤10%，批間變異系數(shù)≤15%，檢測(cè)限為5μg/kg，低于國(guó)家規(guī)定的殘留限，能夠滿足初篩的工作需要。鄭晶等[14]運(yùn)用酶聯(lián)免疫分析方法檢測(cè)了鰻魚(yú)中喹諾酮類藥物殘留，其中此法對(duì)諾氟沙星的靈敏度可達(dá)到0.3μg/kg，對(duì)諾氟沙星的交叉反應(yīng)率最高，對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星及單諾沙星的交叉反應(yīng)率為30%～60%。

另外，其他的免疫分析方法也有相關(guān)報(bào)道。放射免疫分析法是將放射性同位素示蹤技術(shù)和免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)的方法；膠體金免疫層析法則是操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，不需要額外設(shè)備。劉烜等[15]制成了膠體金免疫層析試劑用于快速檢測(cè)樣品中的喹諾酮類藥物殘留，采用免疫競(jìng)爭(zhēng)法，根據(jù)顏色顯示達(dá)到定性目的，靈敏度可達(dá)到10ng/ml，只需3～5min，并且與類似物無(wú)交叉反應(yīng)。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)技術(shù)復(fù)雜多樣，在實(shí)際檢測(cè)工作中應(yīng)合理選擇方法，盡量選擇靈敏度高、特異性好、簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)方法，在保證結(jié)果準(zhǔn)確的同時(shí)提高工作效率。微生物檢測(cè)法靈敏度不夠，檢測(cè)限常高于藥物的最大殘留限量，可用于初篩工作。高效毛細(xì)管電泳法在檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度等方面不如高效液相色譜法，因而此法的應(yīng)用有其局限性。ELISA法操作簡(jiǎn)單、快速、特異性和靈敏度較好、操作安全，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，適合于大批樣品的快速初篩檢測(cè)。高效液相色譜法雖然前處理復(fù)雜，儀器成本較高，但憑借高效靈敏，快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，常與質(zhì)譜聯(lián)用來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行定性確證。

近年來(lái)，喹諾酮類藥物的廣泛使用給農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及其產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易帶來(lái)巨大危害，國(guó)家已經(jīng)禁止對(duì)該藥的使用并對(duì)最大殘留限量做出明確規(guī)定。目前，對(duì)喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)技術(shù)的研究正處于不斷發(fā)展和完善的階段，研究快速、準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)技術(shù)有著廣闊的發(fā)展前景，同時(shí)也為動(dòng)物性產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易提供技術(shù)保障。

[1] 董艷峰, 于靜泉, 張巍. 超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定雞肝中五種氟喹諾酮類藥物殘留[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2010, 44(6)：5-8.

[2] 趙思俊, 李存, 江海洋等. 高效液相色譜檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中7種喹諾酮類藥物的殘留[J]. 分析化學(xué), 2007, 35：786.

[3] 楊守國(guó), 李兆新, 王清印等. 高效液相色譜法檢測(cè)海水養(yǎng)殖環(huán)境中喹諾酮類藥物殘留[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2010, 31(2)：95.

[4] 黃優(yōu)生, 劉波平, 朱筱玲等. 高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定魚(yú)肉中4種氟喹諾酮類藥物殘留[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(2)：127.

[5] Hassouan M K, Ballesteros O,Zafra A, et a1. Multiresi-due method for simultaneous determination of quinolone antibacterials in pig kidney samples by liquid chromatography with fuorescence detection[J]. J Chromatogr B, 2007, 859：282.

[6] 何強(qiáng), 孔祥虹, 李建華等. 超高效液相一串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中15種喹諾酮類藥物殘留[J]. 分析試驗(yàn)室, 2010, 29(3)：101.

[7] 田晶晶, 鄧寧, 何建波. 高效毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)5種喹諾酮類抗生素[J]. 合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 32 (8)：1170.

[8] 李日鋒, 吳虹, 宗敏華. 區(qū)帶毛細(xì)管電泳法同時(shí)分離檢測(cè)6種喹諾酮類抗生素[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2009, 25(12)：1468.

[9] Matthias F, Agnieszka K, Thuy D T V, et a1. Improved capillary electrophoretic separation of nine(fluoro)quinolones with fluorescence detection for biological and environmental samples[J]. J Chromatogr A,2004, 1047：305.

[10] 陳遷. 自動(dòng)化微生物比濁法測(cè)定血清中環(huán)丙沙星濃度[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 1998(3)：190-191.

[11] 黃曉蓉, 鄭晶, 李壽崧等. 鰻魚(yú)及其制品中喹諾酮類藥物殘留的微生物快速檢測(cè)方法研究[J]. 淡水漁業(yè), 2005, 35(4)：3.

[12] 杜黎明, 吳吳, 陳彩萍. 喹諾酮類藥物的分析方法與應(yīng)用[M]. 北京：科學(xué)出版社, 2006：164.

[13] 劉歡歡, 于學(xué)輝, 彭莉等. 用ELISA方法檢測(cè)雞蛋氟喹諾酮類藥物殘留的研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 34(6)：1182.

[14] 鄭晶, 黃曉蓉, 鄭俊超等. 微生物抑制法與酶聯(lián)免疫法檢測(cè)鰻魚(yú)中喹諾酮類藥物殘留的比較研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2006,16(1)：79.

[15] 劉烜, 鄭文杰, 賀艷等. 膠體金免疫層析法快速檢測(cè)組織樣品中喹諾酮類藥物殘留[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2009, 30(5)：131.

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