葛根素抑制癡呆大鼠模型海馬神經(jīng)元凋亡的研究

王文勝，王英杰，宋純彥，王連芹，王建民，胡沛霖

（1.河北省邢臺市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北邢臺054000；2.河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科，河北邯鄲056000）

·論 著·

葛根素抑制癡呆大鼠模型海馬神經(jīng)元凋亡的研究

王文勝1，王英杰2，宋純彥1，王連芹1，王建民1，胡沛霖1

（1.河北省邢臺市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北邢臺054000；2.河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科，河北邯鄲056000）

目的 用癡呆大鼠模型研究海馬神經(jīng)元凋亡機制及葛根素對其干預效應。方法雄性Wistar大鼠36只被隨機分為對照組、癡呆組、治療組，用HE染色、TUNEL染色和流式細胞技術(shù)觀察癡呆大鼠模型海馬神經(jīng)元的凋亡現(xiàn)象及葛根素的影響，采用免疫組織化學染色和Western Blot分析，研究其分子機制是否涉及凋亡基因Bax、Bcl-2和凋亡蛋白酶caspase-3表達變化。結(jié)果①HE染色、TUNEL染色時，對照組海馬凋亡神經(jīng)元少見；流式細胞術(shù)測定大鼠海馬凋亡細胞率顯示，對照組大鼠海馬的凋亡細胞率處于較低水平，癡呆組與對照組比較海馬凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，凋亡細胞率明顯增加（P＜0.05），治療組與癡呆組比較海馬凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，凋亡細胞率明顯降低（P＜0.05）。②癡呆組比對照組大鼠海馬組織Bax、caspase-3蛋白的表達量明顯增加（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達量明顯減少（P＜0.05）；治療組與癡呆組相比大鼠海馬組織Bax、caspase-3的表達量明顯降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達量明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論葛根素能抑制癡呆大鼠模型海馬神經(jīng)元凋亡，可為葛根素治療癡呆提供理論依據(jù)。

阿爾茨海默病；葛根素；大鼠

正常人腦內(nèi)幾乎沒有或很少有細胞凋亡，而阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）患者腦內(nèi)，尤其海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡明顯增加，神經(jīng)細胞凋亡過盛可能是AD神經(jīng)退行性變、神經(jīng)元丟失的一個重要原因［1］。Bcl-2基因家族是很重要的神經(jīng)細胞凋亡調(diào)控基因。其中促凋亡基因Bax、抗凋亡基因包括Bcl-2起著關(guān)鍵的作用。神經(jīng)元凋亡的執(zhí)行主要是通過不同途徑最終激活凋亡蛋白酶caspase-3導致神經(jīng)元凋亡［2］。近年來，在中國、韓國和日本一些天然草藥提取物已經(jīng)被成功地用于防治神經(jīng)元變性［3］。實際上，人們期望使用無毒有效的天然藥物而不是化學藥品治療疾病。葛根素（puerarin）是從豆科葛屬植物野葛的干燥根中提取的一種黃酮甙類（flavonol glycoside）天然藥物單體，化學名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4'，7二羥基異黃酮。作為一種主要的黃酮甙類藥物，葛根素易得到、純度高、穩(wěn)定性好。本研究探討葛根素抑制癡呆大鼠模型海馬神經(jīng)元凋亡的機制，旨在為癡呆患者提供一天然有效的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器：葛根素（生產(chǎn)批號110101）購于浙江康恩貝制藥股份有限公司，β-淀粉樣蛋白25～35片段（β-amyloid protein 25～35，Aβ25～35）購于美國Sigma公司，免疫組織化學染色SP系列試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，聚偏氟乙烯膜（美國）購于Millipore公司，兔抗人Bax多克隆抗體、羊抗大鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗人caspase多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG二抗、HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗、發(fā)光試劑購于美國Santa Cruz公司。Epics-XLⅡ型流式細胞儀購于美國Beckman Coulter公司，SR-6N型立體定向儀購于NARISHIGE SCIENTIFIC公司，307-6臺式牙鉆車購于上海醫(yī)用分析儀器廠，半干轉(zhuǎn)膜儀購于美國BIO-RAD公司，F(xiàn)luor Chem.HD2型化學發(fā)光儀購于美國Alpha Innotech公司，Bio ID數(shù)碼成像分析系統(tǒng)購于Vilber Lourmat公司。

1.2 實驗動物與分組：本研究所用雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量（349.0±11.2）g，由河北省實驗動物中心提供。涉及動物的實驗均得到政府的動物研究委員會批準。36只Wistar大鼠隨機分為對照組、癡呆組、治療組，每組12只。

1.3 方法

1.3.1 制作癡呆動物模型：參照大鼠腦立體定位圖譜［4］，在頂骨上鉆2個小孔。治療組和癡呆組用微量注射器向海馬CA1區(qū)內(nèi)緩慢注射Aβ25～35，雙側(cè)海馬各1μL（10μg），每側(cè)海馬的注射時間超過20min，留針5min，2次注射間隔10min。對照組行假手術(shù)，經(jīng)所有手術(shù)步驟，只是用生理鹽水替換Aβ25～35，即用微量注射器用同樣的時間，雙側(cè)海馬注射等量的生理鹽水。

1.3.2 葛根素給藥方法：治療組給予葛根素腹腔注射治療，相應的癡呆組和對照組給予等量的生理鹽水腹腔注射行假治療。治療組葛根素的用量為150mg/kg。葛根素或生理鹽水治療，1次/d，持續(xù)至術(shù)后21d。

1.3.3 標本的準備：每組取4只大鼠在葛根素腹腔注射治療21d后斷頭處死。迅速剝離出海馬，立即放入70％乙醇中固定，用于流式細胞術(shù)檢測凋亡率。每組再取4只大鼠用于制作石蠟切片。每組的另4只大鼠剝離海馬，提取總蛋白，用于Wester Blot分析。

1.3.4 流式細胞術(shù)：將固定的組織制成單細胞懸液，加入10％雞紅細胞作為內(nèi)參標準，激發(fā)光源為15mW氬離子激光器，激發(fā)波長為488nm，應用Expo 32 ADC進行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，用Muticycle AV分析軟件對DNA細胞周期擬合分析。

1.3.5 Western Blot分析［5］：各組取等量蛋白提取液經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗、二抗結(jié)合后放入化學發(fā)光儀內(nèi)發(fā)光。采用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)Western Blot區(qū)帶進行定量分析，掃描灰度值用積分光密度（integral optical density，IOD）表示。

1.3.6 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色：石蠟切片經(jīng)二甲苯液浸泡，梯度乙醇脫水，蒸餾水洗滌，蘇木素染色，伊紅染色，再分化、脫水、透明、樹膠封片。

1.3.7 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）染色：切片脫蠟至水，經(jīng)蛋白酶K消化，PBS洗，加TUNEL反應液，加顯色液，核固紅復染，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.8 免疫組織化學染色：石蠟切片經(jīng)烘烤，二甲苯浸泡，乙醇梯度脫水，水洗，過氧化氫溶液孵育，抗原熱修復，山羊血清封閉，特異性抗體反應，相應二抗反應，DAB顯色，蘇木精復染，酒精脫水，透明，樹脂封片。

1.4 統(tǒng)計學方法：應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，計量資料以±s表示，分別采用F檢驗和q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 凋亡現(xiàn)象：HE染色的大鼠海馬冠狀切片上不僅能觀察到炎性反應，也可觀察到神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象（圖1）。大鼠海馬錐體細胞帶上可見到神經(jīng)元凋亡，表現(xiàn)為細胞體積縮小，呈多角形、三角形、長條形或紡錘形，胞核與胞漿均濃縮深染，或散在或聚集成團，以CA1區(qū)和CA3區(qū)多見。對照組神經(jīng)元凋亡少見，散在，癡呆組多見，常聚集成團，有的完全占據(jù)海馬錐體細胞帶的一段。治療組介于二者之間。TUNEL染色時上述形態(tài)的神經(jīng)元大部分呈TUNEL染色陽性，證實為神經(jīng)元凋亡（圖2）。對每只大鼠海馬CA1和CA3區(qū)各一個高倍鏡下TUNEL陽性的神經(jīng)元進行細胞計數(shù)，取CA1和CA3區(qū)數(shù)目和，重復3次，取平均值。對照組TUNEL染色陽性的神經(jīng)元少見，癡呆組與對照組比較TUNEL染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加（P＜0.05），治療組與癡呆組比較TUNEL染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。

2.2 細胞凋亡率：流式細胞術(shù)測定大鼠海馬細胞凋亡率，對照組大鼠海馬的凋亡細胞率處于較低水平，癡呆組較對照組凋亡細胞率明顯增加（P＜0.05），治療組較癡呆組凋亡細胞率明顯降低（P＜0.05）。

2.3 促凋亡基因表達：免疫組織化學染色可以顯現(xiàn)Bax蛋白在海馬神經(jīng)元的表達定位及分布。Bax蛋白位于胞漿或細胞骨架上，Bax蛋白免疫組織化學染色陽性顆粒定位于神經(jīng)元胞漿。對照組大鼠海馬Bax蛋白免疫反應陽性的神經(jīng)元少見，癡呆組與對照組比較Bax免疫反應陽性的神經(jīng)元明顯增加，著色更深，治療組與癡呆組比較Bax免疫反應陽性的神經(jīng)元明顯減少，著色變淺（圖3）。采用Western Blot對大鼠海馬組織Bax的表達量進行定量分析，癡呆組比對照組大鼠海馬組織Bax的表達量明顯增加（P＜0.05），治療組與癡呆組相比大鼠海馬組織Bax的表達量明顯降低（P＜0.05）。

2.4 抑凋亡基因的表達：對照組免疫組織化學染色顯示出Bcl-2蛋白在大鼠海馬組織有一定的基礎(chǔ)表達量，免疫反應陽性顆粒定位于胞漿。癡呆組Bcl-2免疫組織化學染色陽性的神經(jīng)元比對照組明顯減少，著色淺；治療組與癡呆組比較Bcl-2的免疫反應陽性的神經(jīng)元明顯增加，與對照組接近（圖4）。Western Blot分析結(jié)果顯示，癡呆組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白表達量較對照組明顯減少（P＜0.05），治療組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白表達量較癡呆組明顯增加（P＜0.05）。

2.5 凋亡相關(guān)酶caspase-3蛋白的表達：免疫組織化學染色顯示，caspase-3蛋白在神經(jīng)元胞漿表達，對照組caspase-3免疫反應陽性神經(jīng)元少見且著色淺，癡呆組caspase-3免疫反應陽性神經(jīng)元多且著色深，治療組介于二者之間（圖5）。Western Blot分析顯示，對照組大鼠海馬組織caspase-3蛋白表達量低，癡呆組比對照組海馬組織caspase-3蛋白表達量明顯增加（P＜0.05），而治療組比癡呆組caspase-3蛋白表達量明顯減少（P＜0.05）。

3 討 論

神經(jīng)元凋亡普遍存在于各種腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程中。神經(jīng)元凋亡是AD發(fā)病進展過程中的重要事件，是神經(jīng)元減少、認知記憶功能減退的主要原因之一［1］。AD患者腦組織內(nèi)的神經(jīng)元凋亡主要見于海馬結(jié)構(gòu)，以CA1區(qū)最多，其次是CA3區(qū)、下腳區(qū)和海馬旁回等部位，而正常人這些部位幾乎見不到神經(jīng)元凋亡。Aβ是AD病理改變形成的主要病因。Aβ對神經(jīng)元具有很強烈的毒性。Aβ刺激神經(jīng)元可出現(xiàn)胞漿水腫，細胞器腫脹、染色質(zhì)濃縮、斷裂等細胞凋亡的征象［1］。Aβ對神經(jīng)元有直接導致凋亡的作用，也可能通過促進自由基的形成、破壞細胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)，降低K+通道的功能，增強活性分子的介導作用誘導神經(jīng)元凋亡。

Aβ誘導的炎性反應是Aβ誘導的類AD的病理改變和大鼠認知障礙的重要機制。本研究發(fā)現(xiàn)凋亡也是神經(jīng)元減少的重要機制。一般認為Aβ誘導凋亡不如Aβ誘導的炎性反應更明顯。我們認為關(guān)于神經(jīng)元凋亡與炎性壞死在AD患者發(fā)病進展過程

中哪種更主要？這個問題目前還沒有確定的答案。炎性壞死與凋亡是AD中同時存在的2種神經(jīng)元死亡形式。在AD中受到致病因素毒性作用強烈破壞的神經(jīng)元，就發(fā)生了炎性壞死，致病因素毒性作用弱，或因未直接作用受損傷輕的神經(jīng)元，部分被修復，部分發(fā)生凋亡。AD是一種慢性進展性的疾病，總體上來說，致病因素的直接毒性作用不會太強，因此凋亡有可能起更主要的作用。本研究中，TUNEL染色和流式細胞術(shù)均提示葛根素具有拮抗Aβ誘導神經(jīng)元凋亡的作用。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)葛根素對轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的抑制作用。NF-κB不僅調(diào)控多種炎性因子的表達，也調(diào)控多種凋亡相關(guān)基因［6］。我們認為，神經(jīng)炎性壞死與神經(jīng)元凋亡有區(qū)別，又是相伴存在的，葛根素的抗凋亡作用可能與葛根素對NF-κB的抑制作用有一定的關(guān)系。

目前認為，細胞凋亡的實現(xiàn)主要通過3種途徑，線粒體途徑、細胞膜途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。3種途徑均最終激活caspase-3發(fā)生神經(jīng)元凋亡。Aβ可引起培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元凋亡和caspase-3的激活［7］。本研究發(fā)現(xiàn)Aβ25～35海馬注射可誘導的大鼠海馬組織caspase-3的表達增加，意味著大鼠海馬細胞凋亡過程的增加，免疫組織化學染色顯示神經(jīng)元內(nèi)caspase-3的表達增加，提示依賴caspase-3的神經(jīng)元凋亡途徑的激活?？梢哉J為這可能是Aβ25～35海馬注射誘導的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡增加的分子機制。細胞凋亡的調(diào)控是由多種基因參與且非常復雜的過程。Bcl-2基因家族在其中起著主要的作用。Bcl-2在腦組織的神經(jīng)元中表達較高，神經(jīng)元依賴Bcl-2的抗凋亡保護作用。AD時Bcl-2在腦組織的神經(jīng)元中表達被抑制，其神經(jīng)保護作用減弱。Bax促進caspase-3活化，從而促進細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)Aβ25～35海馬注射誘導大鼠海馬組織Bax蛋白表達增加，Bcl-2表達減少，提示Aβ通過誘導Bcl-2和Bax的表達變化，增加海馬神經(jīng)元凋亡。

藥物可以通過促進Bcl-2表達、抑制Bax表達減少神經(jīng)元凋亡［8］。葛根素是黃酮甙類中藥有效單體。本研究發(fā)現(xiàn)葛根素抑制Aβ25～35誘導的大鼠海馬組織促凋亡蛋白Bax的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，且抑制凋亡相關(guān)酶caspase-3的表達，這可能是葛根素抑制神經(jīng)元凋亡的分子機制。AD作為一種慢性進展性的老年相關(guān)性疾病，最需要可長期應用的有效的純天然藥品治療。本研究證明葛根素可能就是這樣的藥物。（本文圖見封三）

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（本文編輯：趙麗潔）

PUERARIN INHIBITION ON H IPPOCAMPAL NEURONAL APOPTOSIS IN DEMENTIA RAT MODEL

WANGWensheng1，WANG Yingjie2，SONG Chunyan1，WANG Lianqin1，WANG Jianmin1，HU Peilin1
（1.Department of Neurology，the People's Hospital of Xingtai City，Hebei Province，Xingtai054001，China；
2.Department of Neurology，the First Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056000，China）

ObjectiveTo investigate hippocampal neuronal apoptosismechanisms and effect of puerarin's intervention in dementia rat model.MethodsThirty-six male Wistar rats were randomly divided into control group，dementia group，treatment group.HE staining，TUNEL staining and flow cytometry were used to observe the hippocampal neuronal apoptosis and effect of puerarin in dementia rat model，immunohistochemical staining and Western Blot analysis were performed to study the molecular mechanisms involved in apoptosis genes Bax，Bcl-2 and apoptotic protease caspase-3 expression.Results①In HE staining and TUNEL staining，apoptotic neurons in the hippocampus were rare in control group.Apoptotic cell rate of the hippocampus was measured by flow cytometry.The apoptotic rate in control group was ata low level.The number and the rate of apoptotic neuronswere significantly increased in dementia group compared with those in control group（P＜0.05），while the number and the rate of apoptotic neurons in treatment group decreased significantly compared with those in dementia group（P＜0.05）.②Hippocampal tissue Bax and caspase-3 protein expression were significantly increased（P＜0.05），Bcl-2 protein expression was significantly reduced（P＜0.05）in dementia group compared with control group.In treatment group，hippocampal tissue Bax and caspase-3 protein expression were

Alzheimer disease；puerarin；rats

R742

A

1007-3205（2013）07-0753-04

2012-11-08；

2012-12-13

王文勝（1970-），男，河北南宮人，河北省邢臺市人民醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事腦血管病介入治療及癡呆機制研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.07.004

significantly reduced（P＜0.05），Bcl-2 protein expression was significantly increased（P＜0.05）compared with those in dementia group.Conclusion Puerarin can inhibit hippocampal neuronal apoptosis in dementia rat model and it provide a theoretical basis for puerarin in the treatment of dementia.