歐洲花楸成熟種胚組織培養(yǎng)技術(shù)

包文泉，鄒薇薇，朝洛蒙，白玉娥，田有亮，何炎紅

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 林學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.赤峰天虹花卉市場，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

歐洲花楸Sorbus pohuashanensis，為薔薇科Rosaceae蘋果亞科Maloideae花楸屬Sorbus植物，落葉喬木或灌木，高達8 m，春天花朵為白色，秋天果實為紅色，有很高的觀賞價值[1]。花楸抗性強，對有害氣體的污染有較強抗性，如SO2、SO3、CO2等[2]，非常適于城市造林綠化。在城市園林建設(shè)中常用作城市行道樹、園景樹、庭院點綴、公園樹種搭配等，在風景林中，秋景頗佳，是重要的觀果樹種[3-4]。此外，花楸兼有木材、藥材、水果等多種用途的樹種[5]，是一種沒有被完全開發(fā)利用的優(yōu)良的綠化和經(jīng)濟林樹種?；ㄩ币N馴化成功對豐富城市綠化樹種及綠化建設(shè)具有重要意義[6]。

通過對花楸組織培養(yǎng)再生植株形成和煉苗的研究，對于其在分布區(qū)以外地區(qū)引種和快繁技術(shù)研究具有重要意義，對于大規(guī)模、大范圍的開發(fā)利用不同品種花楸也將起到促進作用。本研究是通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，以成熟種胚為外植體，對基本培養(yǎng)基類型、植物生長調(diào)節(jié)劑種類、濃度與配比、培養(yǎng)條件等進行探索，為進行快速繁殖和無性系培育及進一步的遺傳工程和生理生化研究打基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗中以花楸成熟種胚為外植體，種子采于黑龍江植物園的花楸成熟果實，調(diào)制后在4 ℃冰箱中貯存。

將材料用自來水浸泡18 h，然后用70%的酒精浸泡30 s，再用2%的NaClO溶液攪拌消毒處理10 min，然后在無菌工作臺上用無菌水沖洗5～7次，再用解剖刀切破種皮子葉端，剝出成熟胚待接種之用。

1.2 方 法

1.2.1 不定芽的誘導

把成熟胚接種在附加了不同濃度的6-BA（6-芐基氨基嘌呤）、NAA（萘乙酸）的MS和WPM固體培養(yǎng)基上。每組激素組合接種6瓶，每瓶接種5個種胚。觀察不定芽生長狀況，并在第20天開始統(tǒng)計不定芽誘導率。根據(jù)不定芽誘導率，選擇最佳培養(yǎng)基與激素組合。

1.2.2 不定芽的增殖

觀察不定芽生長狀況，當不定芽生長0.5 cm時轉(zhuǎn)接到附加了不同質(zhì)量濃度的6-BA、IAA激素的MS增殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

1.2.3 不定芽的生根

將增殖到長度1.0～1.5 cm的不定芽接種到附加了不同質(zhì)量濃度的IBA或NAA的1/2MS培養(yǎng)基上，進行生根培養(yǎng)。

1.2.4 培養(yǎng)條件

采用日光燈照射進行光照培養(yǎng)，光照16 h，黑暗8 h，光強2 000～3 000 lx，溫度(25±1) ℃，濕度70%～80%。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

通過統(tǒng)計不定芽和生根的數(shù)量，分別計算出不定芽誘導率和生根率。

不定芽誘導率＝（誘導出不定芽外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100%；

生根率＝（生根不定芽數(shù)/接入不定芽總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對花楸種胚不定芽誘導的影響

2.1.1 不同基本培養(yǎng)基對花楸種胚不定芽誘導的影響

將接種在MS和WPM培養(yǎng)基上的花楸成熟種胚培養(yǎng)7 d后，胚芽膨大（見圖1），3周后部分成熟胚胚芽處出現(xiàn)不定芽（見圖2）。1個月后，不同培養(yǎng)基中花楸成熟胚不定芽誘導率出現(xiàn)差異，誘導不定芽3周后統(tǒng)計誘導情況（見表1）。在MS培養(yǎng)基中，不定芽誘導率為80.33%；在WPM培養(yǎng)基中，不定芽誘導率為60.00%。經(jīng)過X2分析得出，MS和WPM培養(yǎng)基上產(chǎn)生的不定芽誘導率之間有顯著差異，即η＝4.02＞Xα＝3.84。結(jié)果指出MS培養(yǎng)基對不定芽的誘導效果優(yōu)于WPM培養(yǎng)基。

圖1 剛接入培養(yǎng)基中的成熟胚Fig.1 Mature embryo just induced in medium

圖2 開始膨大的種胚誘導的不定芽Fig.2 Adventitious buds from embryo beginning to expand

表1 不同培養(yǎng)基對不定芽誘導的影響Table 1 Effect of different media on adventitious bud induction

2.1.2 不同激素質(zhì)量濃度組合對花楸種胚不定芽誘導的影響

通過對激素質(zhì)量濃度組合篩選，本試驗中選擇了不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA組合研究其對不定芽誘導的影響。將花楸成熟種胚培養(yǎng)12 d后，觀察到生長很好的嫩綠不定芽（見圖3），3周后部分不定芽長到1～2 cm（見圖4）。1個月后，不同激素質(zhì)量濃度組合處理中花楸成熟胚不定芽的誘導率出現(xiàn)差異（見表2）。由表2可以看出，在附加NAA 0.5 mg/L和6-BA 0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基中，不定芽誘導率最高達80.33%，經(jīng)過X2分析得出，激素質(zhì)量濃度組合5與組合1、3、4、6、7、9之間芽誘導率均有顯著差異（X0.05=3.84），即η1-5=7.50 ＞X0.05、η3-5=6.20 ＞X0.05、η4-5=5.08 ＞X0.05、η5-6=6.20 ＞X0.05、η5-7=10.33 ＞X0.05、η5-9=5.08＞X0.05，而其它各組合之間的芽誘導率無顯著差異。在附加NAA 1.0 mg/L和6-BA 0.5 mg/L的WPM培養(yǎng)基中，誘導率最高為60.00%，經(jīng)過X2分析得出，激素質(zhì)量濃度組合6與組合1、2、8、9，組合2與組合7之間芽誘導率均有顯著差異，即η1-6=5.45 ＞X0.05、η2-6=4.29 ＞X0.05、η5-8=4.29 ＞X0.05、η5-9=6.78＞X0.05，而其它各組合之間芽誘導率無顯著差異。

圖3 變綠的種胚誘導的不定芽Fig.3 Green adventitious buds from embryo

圖4 1～2cm長的種胚誘導的不定芽Fig.4 Adventitious buds from embryo at the length of 1-2 cm

表2 不同激素質(zhì)量濃度組合對不定芽誘導率的影響Table 2 Effect of different mass concentration combinations of hormones on induction rate of adventitious buds

2.2 不同激素質(zhì)量濃度組合對花楸種胚不定芽增殖的影響

經(jīng)初代培養(yǎng)誘導不定芽，把不定芽轉(zhuǎn)接到附加了不同質(zhì)量濃度的6-BA、IAA的MS增殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，經(jīng)過2周可進一步誘導增殖出5～13個不定芽（見圖5），與初代培養(yǎng)誘導不定芽的情形相似。培養(yǎng)中，如激素6-BA質(zhì)量濃度過高會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，在后期抑制根的生長[7]。不同激素質(zhì)量濃度組合對不定芽增殖的影響見表3。從表3可以看出，不定芽增殖的最佳激素組合和質(zhì)量濃度為IAA 0.5 mg/L＋6-BA 0.2 mg/L。

圖5 種胚誘導的增殖的不定芽Fig.5 Proliferous adventitious buds from embryo

2.3 不同質(zhì)量濃度的激素對花楸種胚不定芽生根的影響

待不定芽高1.0～1.5 cm時，從基部剪下，移至生根培養(yǎng)基中，5 d后芽基部陸續(xù)出現(xiàn)白色突起或愈傷組織，10～15 d后可見發(fā)達的白色、黃綠色或紅色主根，1個月后大量須根產(chǎn)生，并形成發(fā)達的根系（見圖6、圖7）。激素IBA質(zhì)量濃度對生根數(shù)量的影響如表4所示。在1/2MS培養(yǎng)基中，IBA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L，根數(shù)量最大，不定根誘導率為70%，根長隨著IBA質(zhì)量濃度的逐漸增高而漸漸變短，當IBA質(zhì)量濃度為0.2～0.3 mg/L時，根長差別不大，然后根長逐漸變大，從根的生長狀態(tài)來看，添加IBA的處理中根粗壯，須根多，移栽容易成活。激素NAA質(zhì)量濃度對生根數(shù)量的影響如表4所示。在1/2MS培養(yǎng)基中，NAA質(zhì)量濃度為0.3 mg/L，生根數(shù)量最大，不定根誘導率為50%，隨著NAA質(zhì)量濃度的逐漸變大，根的數(shù)量先增多后減少，當NAA質(zhì)量濃度為0.2～0.3 mg/L時，根長差別不大，然后根長逐漸變大，須根多，移栽容易成活。經(jīng)過X2分析得出，處理6與處理2、4、5、8，處理3與1之間的不定根誘導率有顯著差異， 即η6-2=η6-5=η6-8=5.05 ＞X0.05、η6-4=7.5 ＞X0.05、η3-1=6.67＞X0.05，而其它處理間不定根誘導率無顯

著差異。

表3 不同激素質(zhì)量濃度組合對不定芽增殖的影響Table 3 Effect of different mass concentration combinations of hormones on adventitious buds proliferation

圖6 種胚生根芽苗根部Fig.6 Root of seedlings from embryo

圖7 種胚生根完整芽苗Fig.7 Complete seedling with roots from embryo

表4 不同激素質(zhì)量濃度對不定芽生根的影響Table 4 Effect of different mass concentrations of hormones on adventitious buds rooting

3 結(jié)論與討論

（1）愈傷組織和不定芽誘導

建立高頻再生體系的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)是愈傷組織和不定芽的誘導。高質(zhì)量的誘導組織是進一步誘導分化和生根的前提和基礎(chǔ)[7-8]。本研究中得出，誘導花楸成熟種胚產(chǎn)生不定芽的適宜培養(yǎng)基為MS＋6-BA 0.5 mg/L＋ NAA 0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂6 g/L，WPM＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 1.0 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂6 g/L，其成熟種胚不定芽誘導率分別為80.33%、60.00%。MS培養(yǎng)基的成熟種胚不定芽誘導率比WPM培養(yǎng)基的誘導率高，誘導出的愈傷組織和不定芽質(zhì)量高，具有較大的繁殖潛力。誘導不定芽增殖的最適培養(yǎng)基為MS＋6-BA 0.2 mg/L＋IAA 0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂6 g/L，可誘導增殖出5～13個不定芽。

（2）生根培養(yǎng)

通過生根培養(yǎng)中激素種類和濃度的對比試驗得出，生根培養(yǎng)效果最好的培養(yǎng)基是1/2MS＋IBA 0.2 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂6 g/L，成熟種胚不定芽生根率為70%。當培養(yǎng)基是1/2MS＋NAA 0.2 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂6 g/L時，成熟種胚不定芽生根率為50%。

在生根培養(yǎng)試驗過程中發(fā)現(xiàn)，隨著IBA或NAA質(zhì)量濃度的增加，根變粗?？赡苁且驗楫擨BA或NAA達到一定的質(zhì)量濃度后會抑制根的伸長生長[9-12]，刺激根的增粗生長，增加根系的吸收面積，這有利于移栽成活率的提高[13-16]。但是當IBA或NAA的質(zhì)量濃度高于0.3 mg/L時，根出現(xiàn)肉質(zhì)化，說明較高質(zhì)量濃度的IBA或NAA對生根有毒害作用，影響生根質(zhì)量，造成畸形根的形成，從而阻礙不定根的生長。所以IBA或NAA的質(zhì)量濃度對于不定根的生長發(fā)育具有較大的影響。

及時轉(zhuǎn)瓶是誘導花楸生根培養(yǎng)過程中值得注意的問題。當培養(yǎng)出不定芽翠綠發(fā)亮、根粗壯、根須發(fā)達的植株時，必須及時轉(zhuǎn)瓶到新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，否則將影響植株的生長。一些研究指出，可能是因為外植體在初代培養(yǎng)的過程中，由于本身的生物學特性和培養(yǎng)條件的影響，機體會分泌一些有毒的物質(zhì)，如果不及時轉(zhuǎn)瓶，滲透到培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)會影響培養(yǎng)物的生長和分化；這種狀況也可能是由于生長素在增殖培養(yǎng)基中殘留作用的影響。其原因有待進一步深入研究。

參考文獻：

[1] 王愛芝,沈海龍,張 鵬,等. 花楸合子胚發(fā)育的形態(tài)解剖學觀察[J]. 經(jīng)濟林研究,2012, 30(1)： 133－137.

[2] 高 慧,劉培義. 花楸的扦插繁殖試驗初報[J]. 吉林林業(yè)科技,1997,(3)： 29 － 30.

[3] 李迪民,陳 堅. 天山花楸醇提取物對心肌缺血的保護作用[J]. 西北藥學雜志 ,1998,(2)： 66.

[4] 李迪民,陳 堅. 天山花楸水提取液藥理學研究[J]. 中草藥,1995,26(6)： 302 － 304.

[5] Leder B. Silvies value and byproduet eeonomical value in use through all agesS aucuparia[J]. Allgemeine Forest Zeitsehrift(AFZ),1997,52(10)： 548 － 550.

[6] 于春江,丁長廷,李殿波,等. 綠化樹木花楸及其栽培技術(shù)[J]. 中國林副特產(chǎn) ,1998,(2)： 21.

[7] 王愛芝. 花楸不同外植體的莖叢增生和愈傷組織誘導及植株再生[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學,2004.

[8] 張建瑛. 花楸體胚發(fā)生的外植體和培養(yǎng)基效應及生化物質(zhì)變化研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學,2007.

[9] 沈海龍. 植物組織培養(yǎng)[M]. 北京：中國林業(yè)出版社, 2005：33－40.

[10] 周 微,黃健秋,衛(wèi)志明,等. 云南松成熟胚的不定芽誘導及植株再生[J]. 植物生理學通訊,1995,81(5)： 351－353.

[11] 陳香波,曹孜義. 離體葡萄未成熟胚成苗途徑研究[J]. 果樹科學 ,2000,17(4)： 261 － 264.

[12] 徐剛標,何 方,陳良昌. 銀杏愈傷組織誘導與繼代培養(yǎng)的研究[J]. 中南林學院學報,1999,19(3)： 32－36.

[13] 周 微,黃健秋,衛(wèi)志明,等. 云南松成熟胚的不定芽誘導及植株再生[J]. 植物生理學通訊,1995,81(5)： 351－353.

[14] 羅雪梅,金曉玲,王 征,等. 組培微環(huán)境對再生苗生長的影響[J]. 經(jīng)濟林研究,2012,29(3)： 141－144.

[15] 陳雪鵑,吳 玨,李雪珂,等. 芙蓉菊組培快繁技術(shù)的研究[J]. 中南林業(yè)科技大學學報,2012,31(7)： 100－104.

[16] 辛培堯,劉 巖,李根前,等. 滇楊組培苗的移栽技術(shù)研究[J]. 中南林業(yè)科技大學學報, 2012,31(2)： 23－25.