電脈沖介導(dǎo)的治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗的臨床安全性及免疫原性研究

楊海燕，陳光明，崔一民，趙俠，梅川，饒桂榮，莫國(guó)玉，楊若才，楊富強(qiáng)

我國(guó)是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高發(fā)區(qū)，對(duì)此類(lèi)患者目前尚缺乏有效的治療方法[1]。DNA疫苗將編碼HBV病毒外源蛋白的基因表達(dá)載體直接導(dǎo)入機(jī)體，以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，從而提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能以清除病毒感染[2-3]。Davis等[4]于1993年證實(shí)HBV DNA疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的HBV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，比常規(guī)HBV疫苗更具優(yōu)勢(shì)。目前在美國(guó)，預(yù)防型和治療型HBV DNA疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，初步結(jié)果顯示安全性良好[5-6]。本研究以健康志愿者為研究對(duì)象，觀察自行研制的電脈沖(EP)介導(dǎo)的治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗在體內(nèi)的安全性和免疫原性，為下一步臨床研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本試驗(yàn)篩選足夠多的健康受試者以確保有30名受試者入選研究，分為3個(gè)劑量組，每組10名。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①25～55歲，已婚已育的志愿者，男女不限；②近5年無(wú)乙型肝炎疫苗注射史；③HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb陰性；HBsAb陰性，或HBsAb陽(yáng)性(數(shù)值≤30mU/ml)；ALT及AST正常；④體格檢查：無(wú)有臨床意義的陽(yáng)性體征；⑤胸透：在過(guò)去6個(gè)月中有醫(yī)學(xué)證據(jù)表明胸透結(jié)果無(wú)有臨床意義的異常；⑥心電圖、腹部B超等檢查無(wú)異常；⑦自愿參加本臨床試驗(yàn)，已簽署知情同意書(shū)，同意在研究過(guò)程中不參加任何其他試驗(yàn)研究；⑧實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)：血、尿常規(guī)正常；血生化全項(xiàng)(電解質(zhì)、血糖、肝腎功能、血總膽紅素、心肌酶譜、GGT、ALT等)正常；甲狀腺功能正常；腫瘤生化指標(biāo)(CEA、AFP等)正常；凝血酶原時(shí)間正常；自身免疫抗體[抗核抗體(ANA)和抗雙鏈DNA抗體]正常；⑨育齡期婦女，但篩選時(shí)妊娠試驗(yàn)陰性，并且同意在試驗(yàn)全過(guò)程中采取避孕措施者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①任何嚴(yán)重的活動(dòng)性軀體或精神疾病，被研究者認(rèn)為可能影響試驗(yàn)的評(píng)價(jià)或受試者對(duì)研究方案的依從。包括但不限于任何腎臟、心臟、肺、血管、神經(jīng)、消化、代謝(糖尿病、甲狀腺疾病和腎上腺疾病)疾病、免疫缺陷病、活動(dòng)性感染或癌癥；②有過(guò)敏性體質(zhì)或藥物過(guò)敏史者(青霉素過(guò)敏者)；③酗酒或藥物濫用者，或有酗酒或藥物濫用病史，研究者認(rèn)為會(huì)妨礙對(duì)試驗(yàn)的依從性，影響其參加研究或者影響對(duì)結(jié)果的解釋?zhuān)虎苋焉锲诨虿溉槠趮D女，未婚未育者；⑤拒絕合作或因各種原因不能定期隨訪者；⑥入院前4個(gè)月內(nèi)參加過(guò)開(kāi)發(fā)性藥物的試驗(yàn)，或3個(gè)月內(nèi)參加過(guò)已批準(zhǔn)藥物的試驗(yàn)，或篩選前1年內(nèi)參加過(guò)3個(gè)以上藥物試驗(yàn)研究；⑦受試者不能接受電轉(zhuǎn)染疼痛。

1.3 主要試劑及儀器 常規(guī)生化和血液化驗(yàn)使用醫(yī)院現(xiàn)有設(shè)備。治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗由廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)(規(guī)格1mg/瓶，溶液制劑，批號(hào)：061101/070101/080101)。電脈沖導(dǎo)入儀由上海交通大學(xué)藥學(xué)院研制(型號(hào)TERESAIEPT)?？笻Bs、HBeAg、HBsAg、HBeAb、HBcAb檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)雅培公司。HBV DNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于德國(guó)羅氏診斷有限公司。IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒為美國(guó)R＆D產(chǎn)品?？购丝贵w、抗雙鏈DNA抗體均購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司。

1.4 方法 采用單中心、劑量遞增的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.4.1 給藥時(shí)間 為0、4、12、24周，共4次。試驗(yàn)按低、中、高劑量順序進(jìn)行，在低劑量組最后一名受試者第2次給藥1周后未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)時(shí)，中劑量組開(kāi)始給藥，高劑量組給藥時(shí)間以此類(lèi)推。另外，每個(gè)劑量組又分3次進(jìn)行，先做2例試驗(yàn)藥物，1周后無(wú)明顯異常時(shí)再做3例試驗(yàn)藥物，再過(guò)1周后無(wú)明顯異常時(shí)做5例試驗(yàn)藥物，具體流程見(jiàn)圖1。組內(nèi)每位志愿者給藥時(shí)間間隔不少于1h。每個(gè)劑量組隨機(jī)分為2組，每組5例，分別使用2種不同輸出電壓(60V和36V)的電脈沖導(dǎo)入。從保護(hù)受試者角度出發(fā)，低劑量組在第3次注射后4周仍有60%受試者未產(chǎn)生HBs抗體者及高劑量組第2次注射后已有60%受試者抗HBs陽(yáng)性時(shí)停止試驗(yàn)。

1.4.2 給藥方式及方法 使用前將治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗的2個(gè)質(zhì)粒制劑按1:1配伍混合后于三角肌部位注射，并立即進(jìn)行電脈沖導(dǎo)入。低劑量組和中劑量組每次注射試驗(yàn)藥物時(shí)，于一側(cè)上臂三角肌部位行肌內(nèi)注射，高劑量組可在一側(cè)上臂的三角肌部位注射4mg或在兩側(cè)上臂的三角肌各注射2mg。

1.4.3 觀察指標(biāo) 分別于給藥后0、4、12、29周觀察受試者生命體征、物理學(xué)診斷指標(biāo)(心電圖、胸透、B超)、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)(血、尿常規(guī)，血液生化，凝血酶原時(shí)間，甲狀腺功能，腫瘤標(biāo)記物)、免疫學(xué)檢測(cè)指標(biāo)[干擾素γ(IFN-γ)、抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA抗體]、HBV血清標(biāo)記物(HBsAg、HBcAb、HBeAg、HBeAb、HBV DNA)的變化；于給藥后0、8、12、16、20、24、29周觀察抗HBs的變化。

圖1 健康志愿者試驗(yàn)分組及給藥流程Fig.1 Grouping and flow-sheet of administration in healthy volunteers

2 結(jié) 果

本研究在北京大學(xué)第一醫(yī)院國(guó)家藥品臨床研究基地進(jìn)行，共納入30例健康志愿者。

2.1 生命體征變化 健康志愿者導(dǎo)入治療性疫苗前后，心電圖、胸透未發(fā)現(xiàn)異常，B超發(fā)現(xiàn)在29周時(shí)高劑量60V組中1例脾臟有輕度偏大，可能與用藥有關(guān)，其后自行緩解或恢復(fù)(表1)。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)變化 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者血、尿常規(guī)、凝血酶原時(shí)間全部正常，甲狀腺功能和腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。血液生化指標(biāo)中，低劑量組29周時(shí)1例ALT輕度升高；中劑量組4周、29周時(shí)共2例BUN輕度升高；高劑量36V組4、12周時(shí)2例CK輕度升高；高劑量60V組29周時(shí)1例CK輕度升高。以上均可能與用藥有關(guān)，且全部能自行緩解或恢復(fù)(表2)。

2.3 免疫學(xué)指標(biāo)變化 與用藥前相比，中劑量組IFN-γ下降，可能與用藥有關(guān)。低劑量組第4次未給藥，僅為29周復(fù)查結(jié)果，低劑量組36V和60V在29周各有2例未查IFN-γ。抗核抗體和抗雙鏈DNA抗體全部陰性(表3)。

2.4 血清學(xué)指標(biāo)變化 用藥前后健康志愿者HBV血清學(xué)指標(biāo)全部陰性(表4)。

2.5 免疫原性變化 用藥前后健康志愿者抗HBs在高劑量組36V中較給藥前有升高趨勢(shì)，其中1例受試者給藥后達(dá)到17.22mU/ml，與用藥有關(guān)，說(shuō)明治療性HBV DNA疫苗在大劑量組中存在一定的體液免疫原性(表5)。

表1 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者物理學(xué)診斷指標(biāo)觀察結(jié)果(正常例數(shù)/異常例數(shù)，n=5)Fig.1 Physical diagnosis for volunteers before and after HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP (normal cases/abnormal cases, n=5)

表2 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)觀察結(jié)果(正常例數(shù)/異常例數(shù)，n=5)Fig.2 Blood biochemistry and routines of the volunteers before and after HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP (normal cases/abnormal cases, n=5)

表3 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者自身免疫學(xué)檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果(n=5)Fig.3 Autoimmune response of the subjects before and after HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP(n=5)

3 討 論

DNA疫苗又稱(chēng)核酸疫苗或基因疫苗，具有傳統(tǒng)疫苗所不具備的優(yōu)勢(shì)，其表達(dá)的蛋白質(zhì)可作為內(nèi)源性抗原被遞呈，能夠有效地誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[7]。DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL可識(shí)別和溶解體內(nèi)感染HBV的細(xì)胞，可分泌IFN-γ，并可抑制感染細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制或清除病毒而不引發(fā)細(xì)胞損傷[8]。治療性DNA疫苗研制的目的就是提高那些在常規(guī)治療情況下無(wú)應(yīng)答、處于免疫耐受期的乙肝患者的HBV特異性細(xì)胞免疫水平，力爭(zhēng)打破由HBV長(zhǎng)期感染所引起的機(jī)體特異性免疫耐受狀態(tài)，促使機(jī)體重新恢復(fù)和激活已處于靜息狀態(tài)下的特異性免疫功能，為化學(xué)抗病毒藥治療提供適應(yīng)證，也為那些處于免疫轉(zhuǎn)換期的患者最終清除病毒提供新的手段。

但是，DNA疫苗的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA，其安全性仍然值得關(guān)注。質(zhì)粒DNA與基因組DNA整合的危險(xiǎn)性是臨床前研究中應(yīng)該重視的問(wèn)題，插入的質(zhì)粒DNA可通過(guò)誘導(dǎo)染色體斷裂或重組而造成染色體的不穩(wěn)定。我們?cè)谂R床前研究工作中采用了盡可能的敏感方法檢測(cè)EP介導(dǎo)的雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗的組織分布，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA與宿主基因組DNA的整合，且質(zhì)粒DNA在體內(nèi)代謝較快，不會(huì)在組織中長(zhǎng)期存留和表達(dá)[8-9]。由于雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗中包含了超螺旋雙鏈DNA，且融合表達(dá)人源性細(xì)胞因子(IL-2/IFN-γ)，臨床前及臨床試驗(yàn)研究中都要特別考慮免疫系統(tǒng)中細(xì)胞或體液調(diào)節(jié)組分可能引起的無(wú)法預(yù)料的不良反應(yīng)，如免疫抑制、慢性炎癥、自身免疫或其他免疫學(xué)疾病。從本試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，受試者接受疫苗治療前后生命體征平穩(wěn)，血、尿常規(guī)、血生化、甲狀腺功能、腫瘤標(biāo)記物等未見(jiàn)明顯異常改變，極少數(shù)出現(xiàn)一過(guò)性體檢指標(biāo)的升高或輕度異常，但全部自行緩解或恢復(fù)；ANA、抗雙鏈DNA抗體全部陰性，未檢出佐劑質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物IFN-γ的升高，說(shuō)明其自身免疫狀況穩(wěn)定；本臨床Ⅰ期試驗(yàn)中HBV DNA在治療前后一直處于正常值范圍內(nèi)，說(shuō)明該疫苗DNA未與宿主細(xì)胞基因組DNA發(fā)生整合，提示其遺傳毒理指標(biāo)是正常、安全的。

表4 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者HBV血清標(biāo)記物觀察結(jié)果(陰性例數(shù)/陽(yáng)性例數(shù)，n=5)Fig.4 HBV serology of the volunteers before and aft er HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP (negative cases/positive cases, n=5)

表5 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者抗HBs變化觀察結(jié)果(±s, n=5)Fig.5 Serum anti-HBs status of the volunteers before and after HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP(±s, n=5)

表5 EP介導(dǎo)的HBV DNA疫苗給藥前后受試者抗HBs變化觀察結(jié)果(±s, n=5)Fig.5 Serum anti-HBs status of the volunteers before and after HBV DNA vaccination mediated by in vivo EP(±s, n=5)

The results at the 29th week are those of the repeated detection in the low-dose group, in which the 4th injection was not given for each subject;There was an elevation of anti-HBs in the high-dose group with 36V EP; "－". No detection

Groups 0 week 8th week 12th week 16th week 20th week 24th week 29th week Low-dose group 36V 0.10±0.11 0.04±0.08 0.16±0.06 0.06±0.11 － － 0.00±0.00 60V 0.07±0.08 0.03±0.05 0.23±0.21 0.11±0.25 － － 0.00±0.00 Middle-dose group 36V 0.08±0.06 0.09±0.13 0.17±0.10 0.17±0.14 0.11±0.13 0.05±0.10 0.08±0.10 60V 0.35±0.72 0.29±0.64 0.38±0.62 0.38±0.40 0.59±1.06 0.59±1.06 0.32±0.41 High-dose group 36V 0.14±0.32 0.33±0.74 0.81±1.81 1.67±2.77 2.02±4.32 2.31±4.38 3.47±7.69 60V 0.03±0.07 0.22±0.32 0.27±0.46 0.35±0.43 0.38±0.43 0.20±0.23 0.08±0.17

從本研究中也不難看出，EP介導(dǎo)的雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗誘導(dǎo)健康受試者體液免疫應(yīng)答的免疫原性較低，可能與DNA疫苗主要是以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主有關(guān)；同時(shí)，我們應(yīng)用的佐劑質(zhì)粒將免疫應(yīng)答向Th1方向轉(zhuǎn)化，更有助于細(xì)胞免疫應(yīng)答；我們已報(bào)道的試驗(yàn)結(jié)果[10]證實(shí)HBV DNA疫苗能夠誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫功能，充分說(shuō)明雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗作為治療性疫苗具有其必備的較強(qiáng)的特異性細(xì)胞原性。另外，受試者在接受治療前可能已對(duì)預(yù)防性乙肝表面抗原疫苗不應(yīng)答或本身為免疫耐受的體質(zhì)，故不易產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。再者，本試驗(yàn)采用的是兩點(diǎn)肌注聯(lián)合EP介導(dǎo)，因?yàn)椴捎枚帱c(diǎn)肌注聯(lián)合EP介導(dǎo)可能會(huì)引起較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。

綜上所述，HBV DNA疫苗在健康志愿者中是安全的，其在大劑量組中存在一定的體液免疫原性，本研究結(jié)果可為下一步以HBV慢性感染者為研究對(duì)象提供依據(jù)，以進(jìn)一步考察細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

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