mda－9／Syntenin在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用

譚 云 綜述，鐘 東 審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科 400016）

含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白屬于支架蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)中起承上啟下的作用，在細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)運(yùn)輸及降解、基因表達(dá)等多種體內(nèi)重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PDZ是由最早發(fā)現(xiàn)含有此結(jié)構(gòu)域的post－synaptic density protein－95，drosophila disc large tumor suppressor，zonula occludens－13種蛋白質(zhì)首字母的縮寫而得名，由80～90個氨基酸組成，包含兩個α螺旋和6個β折疊。黑色素瘤分化相關(guān)基因mda－9／Syntenin是PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員之一，其通過特異性的定位調(diào)控體內(nèi)多種分子事件。本文主要就含PDZ結(jié)構(gòu)域的mda－9／Syntenin在腫瘤的侵襲，轉(zhuǎn)移過程中的作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 mda－9／Syntenin的克隆及與分布

黑色素瘤分化相關(guān)基因9（mda－9）是首先在人黑色素瘤細(xì)胞中作為差異表達(dá)基因被克隆出來。采用干擾素β（IFN－β）和蛋白激酶C激動劑mezerein聯(lián)合治療可重新啟動人黑色素瘤細(xì)胞的終末分化過程，并伴隨著其增殖能力的永久性喪失、黑色素合成增加、細(xì)胞表面抗原和表達(dá)基因改變以及細(xì)胞形態(tài)趨于正常黑色素細(xì)胞等變化。通過減差雜交技術(shù)對正常和終末分化人黑色素瘤細(xì)胞的比較，進(jìn)一步確定了黑色素瘤分化相關(guān)基因9（mda－9）的表達(dá)。mda－9cDNA全長約2.1kb，其開放閱讀框架含有894bp，編碼298個氨基酸，預(yù)測相對分子量約為33×103，具有PDZ－1和PDZ－22個PDZ結(jié)構(gòu)域，這一基因隨后被克隆并重新命名為Syntenin。

2 mda－9／Syntenin與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其分子機(jī)制

惡性腫瘤細(xì)胞具有向遠(yuǎn)處組織侵襲并形成轉(zhuǎn)移灶的能力。這一過程首先需要腫瘤細(xì)胞黏附到多種基質(zhì)蛋白上，然后通過基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）降解細(xì)胞外基質(zhì)，隨后遷移進(jìn)入周圍的間質(zhì)中。抑制消減雜交技術(shù)對非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株MCF－7和轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株 MDA－MB－435進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，mda－9／Syntenin在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株中呈過表達(dá)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，MDA－MB－435細(xì)胞系是由M14黑色素瘤細(xì)胞系衍生的而并非是一種原發(fā)的乳腺癌細(xì)胞系，提示mda－9／Syntenin的表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)［1］。與原發(fā)性或者非轉(zhuǎn)移性腫瘤相比，多種轉(zhuǎn)移性乳腺癌和消化道腫瘤細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)mda－9／Syntenin的過表達(dá)；通過促使非轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞 MCF－7以及消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞 Az－521過表達(dá) mda－9／Syntenin后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞伴隨著偽足形成增加等形態(tài)學(xué)改變，腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力明顯增強(qiáng)。mda－9／Syntenin結(jié)構(gòu)域缺失分析的結(jié)果顯示，PDZ－2結(jié)構(gòu)域是該基因促進(jìn)細(xì)胞遷移運(yùn)動的有效結(jié)構(gòu)域。

對原發(fā)性黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的研究發(fā)現(xiàn)，mda－9／Syntenin的表達(dá)隨腫瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)展而上調(diào)［2］。免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，黑色素細(xì)胞向原發(fā)性黑色素瘤進(jìn)展過程中都表現(xiàn)出mda－9／Syntenin表達(dá)水平逐漸增加的趨勢［3］。采用分泌蛋白質(zhì)組生物標(biāo)記技術(shù)在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤病人的葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中亦檢測到mda－9／Syntenin的表達(dá)［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，9個正常皮膚樣本中均未見mda－9／Syntenin表達(dá)，15個皮膚痣中僅檢測到1例mda－9／Syntenin的陽性表達(dá)，30個垂直生長期原發(fā)性黑色素瘤中有24例表達(dá)mda－9／Syntenin，12個轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中有8個呈陽性表達(dá)，提示mda－9／Syntenin的表達(dá)隨腫瘤的進(jìn)展顯著增加；體外研究同時發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞T1P26中mda－9／Syntenin的表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞系M4Beu，明確了mda－9／Syntenin具有參與調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移過程的能力［5］。將重組 mda－9／Syntenin腺病毒（Ad.mda－9／S）轉(zhuǎn)染低轉(zhuǎn)移性FM516－SV和M4Beu細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲以及錨定依賴性生長能力顯著增加；而轉(zhuǎn)染重組反義 mda－9／Syntenin腺病毒（Ad.mda－9／AS）的高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞T1P26惡性生物學(xué)特征受到明顯抑制。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染mda－9／Syntenin的FM516－SV和M4Beu細(xì)胞通過皮下注射方式植入到免疫能力低下的新生大鼠體內(nèi)可顯著增加其自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的能力，而在相同實驗條件下轉(zhuǎn)染重組反義mda－9／Syntenin的T1P26細(xì)胞自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的能力明顯下降，進(jìn)一步證實了mda－9／Syntenin在調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵作用［6］。

分子結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，mda－9／Syntenin調(diào)節(jié)黑色素瘤轉(zhuǎn)移的過程可能是通過黏著斑激酶（FAK），p38絲裂原激活蛋白激酶（p38MAPK），c－JNK，核因子κB（NF－κB）和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶－1（MT1－MMP）信號通路介導(dǎo)的［6－7］。mda－9／Syntenin具有優(yōu)先與纖維連接蛋白信號相互作用的特點，將過表達(dá)mda－9／Syntenin的FM516－SV和 M4Beu細(xì)胞接種到纖維連接蛋白上，可產(chǎn)生更多的肌動蛋白應(yīng)力纖維。而表達(dá)反義mda－9／Syntenin的T1P26細(xì)胞中肌動蛋白微絲和黏著斑的形成減少。提示mda－9／Syntenin表達(dá)引起的細(xì)胞骨架組成和形態(tài)的改變可能與黏著斑激酶FAK相關(guān)。FAK是整合素相關(guān)信號通路的關(guān)鍵成份，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動和侵襲過程中具有重要作用。在低轉(zhuǎn)移性M4Beu細(xì)胞中過表達(dá)mda－9／Syntenin可見磷酸化的FAK顯著增加，而在高轉(zhuǎn)移性T1P26細(xì)胞中下調(diào)mda－9／Syntenin的表達(dá)則伴隨著FAK磷酸化作用的明顯減少。共聚焦研究顯示，WM1341D黑色素瘤細(xì)胞中mda－9／Syntenin與磷酸化的FAK共表達(dá)；在纖維連接蛋白上，mda－9／Syntenin促進(jìn)FAK的磷酸化，繼而激活 MAPK、c－Jun氨基末端激酶（JUK）以及 NF－κB；采用 FAK，p38MAPK，JNK 或者NF－κB任一信號分子的抑制劑處理后，均可顯著抑制mda－9／Syntenin增加細(xì)胞遷移和侵襲能力的特性。人色素瘤細(xì)胞中mda－9／Syntenin通過活化 NF－κB和 MT1－MMP而啟動后續(xù)的信號級聯(lián)反應(yīng)并通過以下模式促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移：腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）結(jié)合后，mda－9／Syntenin誘導(dǎo) FAK 的磷酸化，后者通過磷酸化作用激活p38MAPK，進(jìn)而引起IκB的降解以及胞漿中p65與p50解聚后與靶基因MT1－MMP結(jié)合，大量產(chǎn)生的MT1－MMP與TIMP－2結(jié)合后活化pro MMP－2進(jìn)而產(chǎn)生MMP－2，從而引起腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動、侵襲以及生長能力增加［7］。然而在乳腺癌細(xì)胞中，mda－9／Syntenin并不能誘導(dǎo)MMP－2或者M(jìn)MP－9的產(chǎn)生。由于上述觀察到的黑色素瘤細(xì)胞表現(xiàn)都是種植在纖維連接蛋白上的，因此這一差異可能與細(xì)胞類型以及ECM的誘導(dǎo)信號有關(guān)。

然而，在FAK的C末端序列中也未能發(fā)現(xiàn)與PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的基序，提示mda－9／Syntenin可能與黏著斑中調(diào)節(jié)黏著斑激酶磷酸化作用的其他成份發(fā)生作用。因此，確定mda－9／Syntenin激活FAK過程中的關(guān)鍵作用蛋白，以及后續(xù)的信號事件是了解這一接頭蛋白控制腫瘤轉(zhuǎn)移過程的分子的關(guān)鍵。Boukerche等［8－9］發(fā)現(xiàn)了mda－9／Syntenin首先激活c－Src介導(dǎo)c－Src／FAK信號復(fù)合體大量聚集在細(xì)胞膜上，通過FAK的自身磷酸化作用放大后續(xù)信號或者 mda－9／Syntenin激活c－Src后形成的 mda－9／Syntenin／c－Src復(fù)合體直接與 NF－κB作用以發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。Hwangbo等［10］認(rèn)為FN首先激活 mda－9／Syntenin，其通過PDZ結(jié)構(gòu)域與PKCα對話激活FAK及其后續(xù)信號途徑發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

缺失突變分析結(jié)果顯示，在HEK 293T向I型膠原侵襲過程中需要mda－9／Syntenin 2個PDZ結(jié)構(gòu)域的共同作用；而在乳腺癌細(xì)胞中PDZ－2結(jié)構(gòu)域在mda－9／Syntenin功能中占據(jù)了主導(dǎo)地位。晶體學(xué)研究顯示，PDZ－1結(jié)構(gòu)域K124，R128和K130突變體在多肽結(jié)合界面周圍形成一個高度正電荷的表面有利于脂類結(jié)合，這一界面可抑制mda－9／Syntenin與磷酸肌醇的結(jié)合及其侵襲作用的發(fā)揮。mda－9／Syntenin的這一突變并不影響其與syndecan－2的相互作用卻明顯干擾其與抑癌蛋白 merlin／schwannomin－1（sch－1）的相互作用，提示與之結(jié)合的配體（脂類／多肽）對 mda－9／Syntenin的功能具有調(diào)節(jié)作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)，mda－9／Syntenin介導(dǎo)I型膠原侵襲作用的增加過程需要Rho家族中小的 GTPases，RhoA，cdc42，Rac－1以及活化的H－ras參與，作為Ras下游信號的磷脂酰肌醇－3激酶（PI3K）／Akt以及 MAPK通路在 mda－9／Syntenin誘導(dǎo)的侵襲作用中發(fā)揮重要作用［12］。mda－9／Syntenin過表達(dá)可導(dǎo)致Akt S473和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）－1／2的磷酸化作用增加。然而，抑制p38MAPK或者JNK對于mda－9／Syntenin誘導(dǎo)的I型膠原上的侵襲作用沒有任何影響。由此可見，ECM不同成分的相互作用可通過相應(yīng)的信號途徑影響mda－9／Syntenin的表達(dá)及其后續(xù)的信號級聯(lián)反應(yīng)，但mda－9／Syntenin表達(dá)的最終結(jié)果都會導(dǎo)致細(xì)胞遷移和侵襲能力增加。

3 mda－9／Syntenin與腫瘤相關(guān)蛋白的作用

大量mda－9／Syntenin調(diào)節(jié)Syndecans循環(huán)研究發(fā)現(xiàn)Syndecans可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖，黏附及運(yùn)動能力，從而成為判定腫瘤進(jìn)展和病人存活的指標(biāo)。Syndecan－1參與了 Wnt－1誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌的發(fā)生，并可促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在胰腺癌、消化道腫瘤、乳腺癌和黑色素瘤中均觀察到Syndecan－1表達(dá)上調(diào)；在肝細(xì)胞癌和惡性間皮瘤中Syndecan－4表達(dá)增加并可能與腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)。與正常組織相比，Lewis肺癌細(xì)胞和間皮瘤細(xì)胞中Syndecan－2表達(dá)上調(diào)，其在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)可達(dá)到正常水平2～5倍，并為細(xì)胞周期過程和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用所必需［13］。

酵母雙雜交實驗中采用Syndecans胞漿結(jié)構(gòu)域作為誘餌首次發(fā)現(xiàn) mda－9／Syntenin是Syndecan的結(jié)合蛋白。Syndecans家族4個蛋白質(zhì)的近膜面以及小的胞漿結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上極其相似并在進(jìn)化上高度保守，提示這一部分對于Syndecan功能的發(fā)揮至關(guān)重要。mda－9／Syntenin缺失突變體分析顯示，mda－9／Syntenin通過FYA－C末端氨基酸序列與Syndecans相互作用，但需要mda－9／Syntenin的兩個PDZ結(jié)構(gòu)域同時存在；而mda－9／Syntenin的N末端于其功能的發(fā)揮無關(guān)緊要。mda－9／Syntenin與Syndecans在細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)囊泡上共同表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示，mda－9／Syntenin的PDZ結(jié)構(gòu)域與PIP2的相互作用控制著Syndecan從內(nèi)涵體腔返回細(xì)胞膜的循環(huán)過程。mda－9／Syntenin的兩個PDZ結(jié)構(gòu)域均可與syndecan或者PIP2相互作用，其中PIP2對PDZ1的親和性高于PDZ2。細(xì)胞膜中高水平的PIP2可以完全取代Syndecans，使其離開mda－9／Syntenin并返回到細(xì)胞表面。缺乏與PDZ相互作用的Syndecan不能通過這一通路進(jìn)行循環(huán)而被包裹在胞漿的內(nèi)涵體或者核周區(qū)室內(nèi)，并由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)快速降解。與此同時，大量結(jié)合到Syndecans硫酸肝素鏈上的黏附分子和信號蛋白（FGF受體和整合素）也被包裹到這些內(nèi)涵體中，使得細(xì)胞表面的受體數(shù)量失衡最終導(dǎo)致細(xì)胞擴(kuò)散、黏附及運(yùn)動功能受到抑制。

mda－9／Syntenin與 NF2／schwannomin／merlin NF2 基 因的失活突變體可導(dǎo)致神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤，室管膜瘤和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生；NF2基因的產(chǎn)物稱為NF2蛋白、schwannomin－1（sch－1）或者 merlin，該蛋白的失活可導(dǎo)致甲狀腺癌、肝細(xì)胞癌、神經(jīng)束膜瘤腫瘤的發(fā)生［14］。

NF2在胞膜相關(guān)蛋白和細(xì)胞骨架之間提供調(diào)節(jié)性的連接，作為一種新的抑癌基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號與細(xì)胞骨架之間的連接而在細(xì)胞生長和黏附過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。依據(jù)羧基端16個氨基酸的不同可將NF2蛋白分為2種亞型，即sch－1和sch－2。只有sch－1過表達(dá)時具有抑制生長的能力，提示其羧基端16個氨基酸在調(diào)節(jié)抑癌功能方面具有重要作用。sch－1在C末端的25個氨基酸可與mda－9／Syntenin的兩個PDZ結(jié)構(gòu)域共同調(diào)節(jié)二者的結(jié)合；sch－1的VAFFEEL區(qū)域突變分析確定了這一序列對于mda－9／Syntenin的識別至關(guān)重要。在體內(nèi)和離體情況下，兩種蛋白相互作用并共表達(dá)于細(xì)胞膜內(nèi)面和斑點狀細(xì)胞囊泡中。表達(dá)反義mda－9／Syntenin的成纖維細(xì)胞出現(xiàn)了sch－1亞細(xì)胞定位的改變，提示Syntenin／sch－1相互作用在將sch－1運(yùn)輸并錨定在細(xì)胞膜過程中具有重要作用。

Syntenin與其他蛋白的相互作用 mda－9／Syntenin還分別與白細(xì)胞介素－5（IL－5）受體以及轉(zhuǎn)錄因子Sox4，ephrin B1，谷氨酸受體以及Unc51.1和Rab5相互作用，從而B細(xì)胞發(fā)育和分化的調(diào)節(jié)、控制軸突延伸方向、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等多種生物過程中發(fā)揮重要作用。而且有最近研究表明mda－9／Syntenin通過與泛素相互作用在調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中起著重要的作用［15］。

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