絲素組織工程支架的結(jié)構(gòu)相容性與細(xì)胞相容性

劉小甜，楊明英，鄧連霞，朱良均

（浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州，310058）

1 前言

組織工程技術(shù)是一項用于治療組織和器官缺損的新手段，該技術(shù)通過運用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理與技術(shù)，設(shè)計、構(gòu)建、改良和培養(yǎng)生物活體組織，以修復(fù)和重建組織器官的結(jié)構(gòu)和功能[1]。組織工程技術(shù)的核心是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體。其中，支架材料是該復(fù)合體的主要元素之一，其主要作用包括：①為細(xì)胞粘附提供物理支撐，以支持新生組織的生長，并能被生物降解；②為細(xì)胞增殖、分化、代謝提供空間；③提供特定的宏觀、微觀結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建特定功能的組織或器官；④傳遞化學(xué)或力學(xué)信號，調(diào)控細(xì)胞的形狀。

絲素是蠶絲的一種天然高分子纖維蛋白，含量約占蠶絲的70%～80%，含有18種氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸約占總組成的80%以上。Altman等[2]認(rèn)為絲素蛋白具有如下優(yōu)點：①與其他天然纖維和許多高性能合成纖維相比，有獨特的力學(xué)性能；②在外科領(lǐng)域的應(yīng)用已有很長歷史；③可加工成膜、顆粒、纖維、支架等多種形態(tài)，加工工藝相對簡單；④可通過某些氨基酸的氨基和側(cè)鏈的化學(xué)修飾，較容易地改變表面性能；⑤在體內(nèi)外可以緩慢降解；⑥對生物體無危險性，對其免疫系統(tǒng)的副反應(yīng)較小。因此，絲素蛋白已被廣泛應(yīng)用于組織工程的研究。

2 絲素蛋白支架的生物相容性

組織工程支架材料的生物相容性，包括生物降解性、結(jié)構(gòu)相容性和細(xì)胞相容性等多方面的要求。支架材料的生物降解性，包括生物可降解程度、降解速率影響因素、降解機理等。結(jié)構(gòu)相容性是指，為了滿足生理負(fù)荷的需要，支架應(yīng)提供暫時性的物理支持以承受外部和內(nèi)部的應(yīng)力直至新生組織形成，因而必須與新生組織以及機體的植入部位達(dá)到一定的力學(xué)匹配。細(xì)胞相容性包括細(xì)胞在材料上的黏附，遷移，增殖，分化，凋亡等情況。本文重點介紹絲素支架材料的結(jié)構(gòu)相容性和細(xì)胞相容性的研究情況。

2.1 絲素支架材料的結(jié)構(gòu)相容性

劉洋等[4]以犬牙周膜細(xì)胞為種子細(xì)胞，以殼聚糖—絲素蛋白—磷酸三鈣復(fù)合物作為支架材料，研究該材料用于牙周組織工程的特征。研究表明，以犬牙周膜細(xì)胞為種子細(xì)胞，殼聚糖—絲素蛋白—磷酸三鈣復(fù)合物支架材料與單純殼聚糖支架材料相比，有更適宜的多孔結(jié)構(gòu)及較理想的骨誘導(dǎo)作用，具有更強的結(jié)構(gòu)相容性和再生能力，可作為牙周組織再生的理想支架材料。

鞠剛等[5]用軟骨誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞接種于絲素蛋白/羥基磷灰石支架材料上，發(fā)現(xiàn)復(fù)合材料無論是在機械強度上還是誘導(dǎo)分化上均比單一材料更符合軟骨組織的生理結(jié)構(gòu)和特點，新生的組織在大體和組織形態(tài)上類似正常軟骨組織，能夠形成透明軟骨，修復(fù)動物膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損，重建關(guān)節(jié)的解剖結(jié)構(gòu)和功能。脂肪干細(xì)胞和SF/HA復(fù)合支架體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的軟骨樣組織和軟骨下骨組織與周圍正常組織融合良好，為今后組織工程修復(fù)軟骨中復(fù)合材料的應(yīng)用進(jìn)行了新的嘗試并提供了可能性。

Sarmistha Talukdar等[6]用冷凍干燥法制得絲素蛋白三維支架，研究了支架與接種細(xì)胞的密度之間的相互影響。結(jié)果表明，絲素蛋白支架作為一個細(xì)胞相容性良好的載體，能夠克服潛在的不足，對細(xì)胞的生長和擴增有良好的支持作用。而接種細(xì)胞的密度對材料的生物化學(xué)和生物力學(xué)方面的特性也有顯著地實質(zhì)性影響，在一定范圍內(nèi)，密度越大，材料的韌性越好。

Mengqing Zang等[7]通過冷凍干燥法制得了導(dǎo)管狀的絲素—殼聚糖混合支架，將鼠的軟骨細(xì)胞接種在支架上，并將支架用一層軟骨膜包裹，培養(yǎng)6周后將所得到的支架—細(xì)胞—軟骨膜材料移植到裸鼠背部皮下袋中，試驗結(jié)果表明所得的支架—細(xì)胞—軟骨膜材料在小鼠體內(nèi)雖然并未形成類似天然的導(dǎo)管，但該支架材料具有良好的生物相容性，促進(jìn)細(xì)胞的生長和擴增使其具有極好的力學(xué)性能，向氣管移植方面研究出類似天然氣管的功能支架材料邁進(jìn)了一步。

Nandana Bhardwaj等[8]制備了絲素和殼聚糖的多孔聚電解質(zhì)混合物，電鏡下觀察材料的孔徑為100～160 μm，具有良好的相互連通性，高孔隙率和適宜的抗菌性。與單一材料相比較而言，材料呈現(xiàn)出較高的抗壓強度和彈性模量，且促進(jìn)貓的成纖維細(xì)胞的生長和粘附，具有良好的生物相容性，是一種很有前景的軟骨組織工程材料。

Jiankang He等[9]用自上而下組裝的方法制得絲素—明膠微流體復(fù)合支架材料。研究表明SF/G比例為2∶2時，復(fù)合材料具有較好的結(jié)構(gòu)特征，機械性能和生物學(xué)特性。材料中的微流體孔道在由上而下組裝的過程中保持良好并互相連通。研究設(shè)想若將微流體孔道中灌注培養(yǎng)基來提高材料的養(yǎng)分和含氧量，則材料有望用作厚組織工程材料。

2.2 絲素支架材料的細(xì)胞相容性

佘榮峰等[10]將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)后，與絲素蛋白/殼聚糖三維支架材料體外共培養(yǎng)。研究表明，經(jīng)誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架材料上黏附、生長良好，材料無細(xì)胞毒性，保持正常的分裂增殖速度；隨時間的增加，細(xì)胞黏附率增加，材料組較對照組黏附率強。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種48 h后細(xì)胞生長良好，與支架黏附緊密，增殖分裂正常。說明絲素蛋白/殼聚糖三維支架材料具有良好的細(xì)胞相容性，可以作為軟骨組織工程研究種子細(xì)胞的載體。

林靜等[11]用鹽瀝濾法制備三維多孔絲素支架。在絲素多孔支架上培養(yǎng)人成骨肉瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及肝細(xì)胞。研究材料的細(xì)胞相容性，發(fā)現(xiàn)多種動物細(xì)胞在鹽瀝濾法所制備的絲素多孔支架材料上能夠很好地黏附和增殖。并通過調(diào)整絲素水溶液的濃度、溶解絲素溶劑體系、NaCl添加量和NaCl粒徑，可以改變材料的力學(xué)性能、孔隙率、孔壁厚度等，制備出結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可以調(diào)控的三維支架。

侯春春[12]以絲素蛋白溶液和自制碳酸鈣為原料，通過調(diào)節(jié)其共混質(zhì)量比、采用不同的制備方法，探索絲素蛋白/碳酸鈣復(fù)合支架的制備工藝，并對其理化性能和生物相容性進(jìn)行了相關(guān)測試。該試驗中通過急性全身毒性試驗、皮膚致敏試驗、皮內(nèi)刺激試驗、熱源試驗、溶血試驗、細(xì)胞毒性試驗、體外降解率測定等一系列試驗證實，復(fù)合支架具有良好的生物相容性，具備發(fā)展成為優(yōu)越的骨組織工程材料的潛力。

Laura J.Bray等[13]制作的雙層絲素支架材料，并在材料上培養(yǎng)角膜緣上皮細(xì)胞（L-EC）和角膜緣間質(zhì)干細(xì)胞（L-MSC），比較觀察了兩種細(xì)胞在有孔和無孔材料上的生長和表型。研究表明，兩種細(xì)胞在有孔材料和無孔材料上生長表現(xiàn)出不同的形態(tài)。兩種細(xì)胞在雙層絲素支架材料上的生長與單層絲素膜呈現(xiàn)相似的形態(tài)，該結(jié)果支持由絲素三維支架制備角膜緣的可行性。

Chinmoy Patra等[14]將一種印度柞蠶絲制備絲素蛋白支架用于體外的心臟修復(fù)。試驗將三日齡小鼠心室心肌細(xì)胞接種于材料上，測試了細(xì)胞對材料的粘附性，細(xì)胞的代謝活性，細(xì)胞對外來刺激的反應(yīng)，細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息傳遞以及細(xì)胞的收縮性。研究表明，絲素蛋白具有與纖連蛋白——心肌細(xì)胞基質(zhì)中的一種成分類似的特性。而且這種柞蠶絲蛋白含有RGD序列，呈現(xiàn)出比普通絲素更優(yōu)越的性能。因此，該材料有望用于心臟疾病的修復(fù)。

Tullia Maraldi等[15]研究了人羊水膜干細(xì)胞（AF?SCs）培養(yǎng)在不同多孔支架上時合成礦化細(xì)胞外基質(zhì)的潛力，多孔支架材料分別由膠原蛋白，外消旋聚乳酸和絲素蛋白制備。研究表明，三維的支架材料的應(yīng)用使AFSCs成骨細(xì)胞的分化能力和礦化細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)量都明顯高于二維材料。可見AFSCs具有在體內(nèi)產(chǎn)生三維礦化生物工程材料的巨大潛力，而且絲素蛋白可能是用來修復(fù)臨界骨缺損的有效支架材料。

3 結(jié)語

絲素蛋白作為一種天然的高分子材料，具有良好的生物相容性，降解性，可改良性和拉伸機械性能等。絲素蛋白是由天然氨基酸疏水段和親水段組成的嵌段復(fù)合物，疏水段可通過氫鍵和疏水基團的相互作用形成β-平面或晶體，從而產(chǎn)生較高的力學(xué)強度，為絲素支架提供優(yōu)良的結(jié)構(gòu)相容性。而且，絲素蛋白作為一種良好的細(xì)胞生長介質(zhì)，能夠很好地促進(jìn)細(xì)胞的生長和繁殖，具有良好的細(xì)胞相容性。因此，絲素蛋白支架材料在組織工程領(lǐng)域具有很好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

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