家蠶生物反應(yīng)器的研究概述

崔振騰，陳亞潔，曾鵬，金衛(wèi)明，費(fèi)建明，李玉峰，時(shí)連根

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000）

家蠶生物反應(yīng)器的研究概述

崔振騰1，陳亞潔1，曾鵬1，金衛(wèi)明2，費(fèi)建明2，李玉峰2，時(shí)連根1

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000）

家蠶生物反應(yīng)器在生產(chǎn)活性成分、表達(dá)外源基因、改善蠶絲性能等方面，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值。本文概述了家蠶幼蟲反應(yīng)器、家蠶NPV表達(dá)系統(tǒng)反應(yīng)器、轉(zhuǎn)基因家蠶反應(yīng)器、家蠶絲腺反應(yīng)器的研究狀況。

家蠶；轉(zhuǎn)基因；絲腺；BmNPV表達(dá)系統(tǒng)；生物反應(yīng)器

家蠶（Bombyxmori）屬于鱗翅目蠶蛾科，為開放式血管系統(tǒng)，纖薄而強(qiáng)韌的表皮層包圍著一個(gè)充滿血淋巴及各種器官的空間，整條蠶像一套完全能調(diào)節(jié)的極其微妙的生物反應(yīng)器，吃進(jìn)飼料（桑葉），合成出蛋白質(zhì)（絲蛋白等）。幾千年來，人們利用家蠶能吐絲結(jié)繭這一生物反應(yīng)器機(jī)能，大量生產(chǎn)生絲。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和科學(xué)技術(shù)進(jìn)步，家蠶這一生物反應(yīng)器機(jī)能被用來生產(chǎn)藥物等高附價(jià)值物質(zhì)，給古老的養(yǎng)蠶業(yè)注入了新的活力。本文對家蠶幼蟲反應(yīng)器、家蠶NPV（Nuclear Polyhedrosis Virus）表達(dá)系統(tǒng)反應(yīng)器、轉(zhuǎn)基因家蠶反應(yīng)器、家蠶絲腺反應(yīng)器的研究狀況作一簡要概述。

1 家蠶幼蟲生物反應(yīng)器

家蠶幼蟲以桑葉為飼料，每頭蠶在20多d內(nèi)僅吃桑葉20 g，體重卻從剛孵化時(shí)的0.5mg增加到5齡期的5 g，增長了10000倍，這是其它任何生物所不能及的。被蠶食下的桑葉在體內(nèi)經(jīng)過一系列的分解與吸收，轉(zhuǎn)化成豐富的活性成分并在體內(nèi)累積，這一高效率物質(zhì)轉(zhuǎn)化與累積特性，使家蠶幼蟲成為活性成分生產(chǎn)的適宜生物反應(yīng)器，其中1-脫氧野尻霉素（DNJ）、黃酮類化合物、蠶素（PTTH）、蛻皮激素（MH）、三碘甲腺原氨酸（T3）等降血糖的活性成分、不飽和脂肪酸等調(diào)節(jié)血脂的活性成分、氨基酸等護(hù)肝的活性成分，廣泛被人們所研究和利用。

家蠶幼蟲體中DNJ含量可達(dá)0.448%以上，大大高于過去認(rèn)為富含DNJ的桑葉（0.11%）、野跖草（0.01125%）、風(fēng)信子（0.0012%）等植物中的DNJ含量，在人腸腔內(nèi)能競爭性地與α-糖苷酶結(jié)合，阻害α-糖苷酶對二糖的水解，使二糖不能被水解成單糖而被直接送入大腸排泄，從而有效地起到了降血糖的作用［1～2］。家蠶幼蟲體富含黃酮類化合物，其含量可達(dá)23.770 mg/g，并在不同蠶品種、性別、生長發(fā)育間存在明顯差異，能清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗脂質(zhì)過氧化、促進(jìn)胰島素B細(xì)胞分泌胰島素以及抑制機(jī)體小腸蔗糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶等雙糖酶的活性，從而降低糖尿病患者的血糖水平，并阻止并發(fā)癥的發(fā)生［3～5］。PTTH是由腦神經(jīng)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)多肽，存在于家蠶各個(gè)不同發(fā)育階段，與人類、哺乳動物的胰島素及類胰島素生長因子族（IGFS）結(jié)構(gòu)相似，被稱為昆蟲胰島素，具有降血糖的功效［6］。MH是一種甾族激素，由前胸腺分泌，在家蠶幼蟲體內(nèi)有α-蛻皮激素和β-蛻皮激素兩種類型，具有促進(jìn)人體細(xì)胞生長、刺激真皮細(xì)胞分裂、產(chǎn)生新的生命細(xì)胞和生殖細(xì)胞、提高人體抗衰老、促進(jìn)胰島細(xì)胞更新再生等，以達(dá)到治療糖尿病的作用。家蠶幼蟲體中T3的干物含量為0.913 ng/g，可影響機(jī)體胰島素水平并作用于其受體［7］，是另一條降血糖途徑。

家蠶幼蟲體含有高比例的不飽和脂肪酸（占油脂量的93%），其中屬于人體必需脂肪酸的α-亞麻酸、亞油酸含量高達(dá)30.95%、13.49%，此外還含有較高的維生素A。α-亞麻酸具有明顯的降血壓、降血脂、降膽固醇的作用，同時(shí)也具有較好的抗炎作用［8］。以家蠶幼蟲為主要原料制成的金蠶寶降脂Ⅰ號和金蠶寶降脂Ⅱ號對高脂模型小鼠的血脂水平具有明顯的改善作用，并顯示出很好的劑量效應(yīng)關(guān)系［9］。

家蠶幼蟲體富含氨其酸，總量的46.51%，為鮮蠶蛹的4～5倍。必需氨基酸占總氨基酸量的41.80%。其中甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸分別占16%、11.8%、8.4%［10］。如此豐富的氨其酸組成，適用于蛋白代謝障礙、白蛋白低下的患者，也有利于提高機(jī)體免疫力、強(qiáng)身健體等，從而間接地起到護(hù)肝作用。以熟蠶粉為主要原料研制成的五齡丸，對慢性、遷延性肝炎、肝炎肝硬化（穩(wěn)定期）、急性黃疸性肝炎（遷延恢復(fù)期）患者均表現(xiàn)出良好的臨床療效［11］。

2 家蠶NPV表達(dá)系統(tǒng)生物反應(yīng)器

家蠶NPV基因組是超螺旋的閉環(huán)雙鏈DNA，主要編碼100余種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中多角體蛋白基因具有非常強(qiáng)有力的啟動子，在病毒感染后期進(jìn)行高效表達(dá)，合成量能達(dá)到全部蛋白質(zhì)量的20～ 30%，但多角體蛋白基因不是病毒復(fù)制的必需基因，多角體蛋白基因即使部分或全部被其它外源基因取代，仍能形成有感染性的病毒粒子。根據(jù)這一特性，將外源基因取代多角體蛋白基因的全部或一部分并處于多角體蛋白基因啟動子的控制之下，形成重組質(zhì)粒，與野生型家蠶NPV DNA共轉(zhuǎn)染于家蠶細(xì)胞，外源基因通過體內(nèi)同源重組而置換出多角體蛋白基因，然后通過空斑篩選等方法分離、純化出重組病毒，純化的重組病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中擴(kuò)增繁殖后，感染家蠶體，外源基因大量表達(dá)，收集蠶血淋巴，經(jīng)過離心、沉淀、透析和純化等手段分離純化出外源蛋白。

家蠶NPV表達(dá)系統(tǒng)最早由Maeda于1984年開發(fā)出來，并首次在家蠶幼蟲體中表達(dá)了人α-干擾素基因，表達(dá)的產(chǎn)物不僅具有生理活性，而且表達(dá)量是其它真核生物表達(dá)系統(tǒng)最高表達(dá)量的千倍以上［12］，顯示出明顯的優(yōu)勢，引起了人們的強(qiáng)烈興趣。至今巳用家蠶NPV表達(dá)系統(tǒng)在家蠶體內(nèi)成功地表達(dá)了乙肝表面抗原的M蛋白基因、丙肝病毒核心蛋白C的完整基因和包膜蛋白E1完整基因及部分E2基因、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型基因env和p40、人免疫缺陷病毒基因gag、gpl20、gp41、pol、sor等，表達(dá)產(chǎn)物作為人疫苗而使用［13～15］；表達(dá)了人生長激素、人β-干擾素、類胰島素樣生長因子-Ⅱ融合蛋白、人白細(xì)胞介素3、人表皮生長因子、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、人血小板生成素、人促紅細(xì)胞生成素、人體血液凝固阻塞因子等，作為人藥而利用［16～19］；表達(dá)了小鼠白細(xì)胞介素3、豬生長激素、草魚的生長因子、禽馬立克氏病毒糖蛋白B抗原、傳染性雞法氏囊病病毒主要宿主保護(hù)性抗原VP2蛋白等，作為獸藥而利用［20～21］；表達(dá)了利尿激素基因、保幼激素酯酶基因、澳洲蝎毒索液的AaIT基因、慈姑蛋白酶抑制劑B基因等，表達(dá)產(chǎn)物用于害蟲防治［22～25］。其中有些已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，產(chǎn)生了巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

3 轉(zhuǎn)基因家蠶生物反應(yīng)器

將外源基因轉(zhuǎn)入并整合進(jìn)家蠶基因組，使其能穩(wěn)定傳代與高效表達(dá)，獲得目的轉(zhuǎn)基因家蠶。標(biāo)準(zhǔn)化繁育與飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因家蠶，外源基因隨著家蠶的高速生長而大量表達(dá)，從而利用此轉(zhuǎn)基因家蠶生物反應(yīng)器可大量獲取外源蛋白。轉(zhuǎn)基因家蠶生物反應(yīng)器克服了桿狀病毒等載體表達(dá)系統(tǒng)中外源基因不能穩(wěn)定傳代、需要反復(fù)擴(kuò)增繁殖與接種、工作量大以及穩(wěn)定性差等諸多問題，具有很高的產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢。

Tamura等于2000年通過將家蠶細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白基因啟動子控制綠色熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)基因載體和表達(dá)轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒一起顯微注射入家蠶卵，經(jīng)過篩選成功獲得120頭發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因家蠶，初步建立了家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系［26］。此后家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷改進(jìn)，轉(zhuǎn)基因家蠶生物反應(yīng)器研究快速進(jìn)展。家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系主要包括轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建和導(dǎo)入宿主表達(dá)二個(gè)方面。轉(zhuǎn)基因載體通常由啟動子、外源基因、篩選標(biāo)志基因、酶切位點(diǎn)、復(fù)制啟動位點(diǎn)等遺傳學(xué)元件構(gòu)成，其構(gòu)建恰當(dāng)與否，將直接影響到基因轉(zhuǎn)移與整合的成敗。目前在轉(zhuǎn)基因家蠶研究中，常用的是以轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，就是將外源基因插入轉(zhuǎn)座子編碼轉(zhuǎn)座酶的序列內(nèi)，構(gòu)成一個(gè)基因轉(zhuǎn)移載體，另外再構(gòu)建一個(gè)表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒，將基因轉(zhuǎn)移載體和輔助質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入家蠶，輔助質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)座酶，引發(fā)基因轉(zhuǎn)移載體中攜帶外源基因片段的轉(zhuǎn)座子序列發(fā)生轉(zhuǎn)移，將外源基因插入宿主基因組內(nèi)，得到外源基因穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因家蠶。

將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入家蠶體表達(dá)的方法主要有顯微注射法、電穿孔法、精子介導(dǎo)法等。①顯微注射法是在顯微鏡下，先用鎢針在家蠶受精卵的一端開孔，刺破堅(jiān)硬卵殼，然后在孔口處插入玻璃針刺人卵內(nèi)，同時(shí)注人外源基因的方法［27］。蠶卵在產(chǎn)下2～3 h后發(fā)生雌、雄核島的融合，形成受精卵，以后每隔1 h分裂1次，約12 h后形成胞胚，25 h后形成囊胚，10 d后形成幼蟲孵化。外源基因轉(zhuǎn)移人受精卵的時(shí)間應(yīng)該在分裂核時(shí)期，因?yàn)榇藭r(shí)分裂核尚未形成核膜，轉(zhuǎn)移入卵內(nèi)的外源DNA較易與分裂核接觸而整合到核內(nèi)基因組中，但卵齡越早的受精卵生命力越弱，越易造成損傷致死。在產(chǎn)下12 h后轉(zhuǎn)移入蠶卵內(nèi)，則轉(zhuǎn)基因不能成功，因?yàn)榇藭r(shí)的分裂核已形成核膜，外源基因難以進(jìn)入核內(nèi)。②電穿孔法是通過瞬時(shí)高壓造成細(xì)胞膜穿孔，將外源基因由孔進(jìn)入蠶卵內(nèi)的方法，由于瞬時(shí)高壓造成細(xì)胞膜的穿孔是可修復(fù)的，所以較玻璃針注射造成損傷致死的程度要?。?8］。另外，有人還利用卵殼上5000～10000個(gè)氣孔（口直徑3～4μm），采取脈沖交變電場介導(dǎo)外源基因由氣孔進(jìn)人卵內(nèi)。③精子介導(dǎo)法是將成熟精子與外源基因進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后，通過授精使精子攜帶外源基因進(jìn)人卵中的方法，其應(yīng)用大致有以下四種方式：第一是將外源基因先注人處女蛾交配囊中，再令其與雄蛾交配，進(jìn)人交配囊的精子攜帶外源基因授精；第二是先令雌雄蛾交配，再向交配囊中注射外源基因；第三是從雌雄蛾交配特定時(shí)間后的交配囊中取出精液，將精液與外源基因孵育一定時(shí)間，然后再將其以人工授精的方法注人新鮮處女蛾交配囊內(nèi)；第四是將含外源基因的質(zhì)粒注人5齡蠶精巢，將其羽化后的雄蛾與處女蛾交配［29］。

4 家蠶絲腺生物反應(yīng)器

5齡后期家蠶體腔內(nèi)充滿后部絲腺，絲素蛋白基因在后部絲腺中特異而高效地得到表達(dá)。在家蠶5齡后期的3 d中，后部絲腺的每個(gè)細(xì)胞能夠合成105個(gè)（約250μg）絲素蛋白分子，整個(gè)絲腺每秒能合成6×109個(gè)絲素蛋白分子，比肝細(xì)胞合成血清白蛋白快60倍以上，這樣高的蛋白合成速度在現(xiàn)有的其他動物細(xì)胞內(nèi)是罕見的。如將外源基因置于絲素蛋白基因啟動子的調(diào)控下，就能利用家蠶絲腺細(xì)胞高效表達(dá)外源基因，不僅表達(dá)量幾十倍地高于家蠶NPV表達(dá)系統(tǒng)等，而且表達(dá)的外源蛋白純度高，無需進(jìn)行煩瑣的下游濃縮和提純處理。為此，家蠶絲腺生物反應(yīng)器具有非常大的開發(fā)前景。

家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)外源基因主要有兩個(gè)方面的應(yīng)用：一是開發(fā)家蠶的生產(chǎn)潛力，利用家蠶表達(dá)外源基因來生產(chǎn)外源蛋白；二是利用轉(zhuǎn)基因操作來改善蠶絲絲素的性能。

4.1 家蠶絲腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白

自從1998年Marshal［30］提出將外源基因置于絲素蛋白啟動子調(diào)控下，在絲腺中生產(chǎn)外源蛋白的構(gòu)想以來，利用絲腺細(xì)胞完整地表達(dá)生產(chǎn)外源蛋白的研究取得了很大成果。朱成鋼等從家蠶基因組DNA中克隆了絲素蛋白輕鏈基因中長度分別為5 kb和0.5 kb的兩個(gè)片段；在綠色熒光蛋白基因前端加上凝血酶的識別序列，將其克隆到輕鏈基因5 kb和0.5 kb兩個(gè)片段中并使其具有正確的瀆碼框，再與輕鏈基因融合；將這一融合DNA片段克隆到pBacPAK8轉(zhuǎn)移載體上，構(gòu)建成一種新型的家蠶打靶載體pBac FL53TG，使綠色熒光蛋白基因在家蠶絲腺內(nèi)特異地表達(dá)［31］。目前日本廣島縣產(chǎn)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所研究人員構(gòu)建了一個(gè)能生產(chǎn)包括普通絲蛋白、熒光標(biāo)識物和縮短型人類Ⅲ型膠原前驅(qū)體分子的融合蛋白質(zhì)的DNA序列，將該DNA序列插入載體，再用顯微注射法將載體質(zhì)粒導(dǎo)入蠶卵，家蠶成熟后，其后部絲腺細(xì)胞將合成融合蛋白，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外經(jīng)吐絲結(jié)成繭，從繭層中即可提取分離獲得人膠原蛋白［32］。

4.2 家蠶絲腺生物反應(yīng)器改善蠶絲性能

蠶絲具有優(yōu)良的光澤、色調(diào)、吸濕放濕性、保溫性、難燃性、吸氣性以及吸收紫外線和放射性等特性，但在摩擦強(qiáng)度、屈曲強(qiáng)度、伸長疲勞度、染色性、抗皺性等性質(zhì)上不及其他纖維。如用其他優(yōu)等絲素基因置換家蠶絲素蛋白基因，就能讓家蠶吐出其他優(yōu)等絲；如用外源基因置換部分家蠶絲素蛋白基因，或?qū)⑼庠椿蛑糜诮z素白基因下游，使外源基因與家蠶絲素基因同時(shí)同步地表達(dá)，就能改善家蠶蠶絲的性能。

李振剛等（1997）將天蠶絲素基因插入酵母人工染色體（YAC）載體中，構(gòu)建包含了整個(gè)天蠶絲素基因編碼區(qū)及側(cè)翼序列的天蠶絲素基因的YAC克?。ˋfy-1），從Afy-1中制備出Afy-1 DNA，采用顯微注射法將Afy-1 DNA導(dǎo)入家蠶受精卵，在F1代中出現(xiàn)了約20%的淡綠色繭，F(xiàn)2代中有近60%繭為淡綠色，分子雜交實(shí)驗(yàn)證明天蠶絲素基因已經(jīng)整合到家蠶基因組中，絲素蛋白氨基酸組分分析、繭色及繭絲溶解性比較也確定天蠶絲素基因在轉(zhuǎn)基因家蠶中得到了表達(dá)［33］。

蜘蛛絲不僅具有蠶絲般的柔軟和光澤，并且其力學(xué)強(qiáng)度明顯比蠶絲大，它與強(qiáng)度最高的碳纖維相接近，因此蜘蛛絲在國防、軍事（防彈衣）、建筑等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。將蜘蛛絲的牽引絲基因替換家蠶絲素重鏈基因，構(gòu)建一個(gè)完整的在家蠶絲素重鏈啟動子引導(dǎo)下的蜘蛛絲牽引絲基因表達(dá)單元，再將此表達(dá)單元導(dǎo)入piggyBac質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，用顯微注射法將轉(zhuǎn)基因載體注入蠶卵，蜘蛛絲基因在家蠶絲腺中得到表達(dá)，使家蠶吐出含有蜘蛛絲蛋白的優(yōu)良復(fù)合繭絲［34］。

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Review on the Research of Bombyx mori Bioreactor

CUIZhen-teng1,CHEN Ya-jie1,ZENG Peng1,JINW ei-m ing2,FEI Jian-m ing2, LIYu-feng2,SHI Lian-gen1

（1.College of Animal Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 2.Huzhou Academy of Agricultural Sciences,Huzhou 313000 Zhejiang,China）

The bioreactor of the silkworm,Bombyx mori showed high development and utilization value in producing active ingredients,expressing foreign genes,and improving properties of silkworm silk etc.The research advancement of silkworm larvae bioreactor,Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus(BmNPV)expression system bioreactor,transgenic Bombyx moribioreactor,silk glands bioreactor ismainly expounded in this paper.

Bombyxmori;transgenic;silk gland;BmNPV expression system;bioreactor

S881.2

A

0258-4069［2013］03-001-05

湖州市科技支撐計(jì)劃攻關(guān)項(xiàng)目（編號：2011GG16）

崔振騰（1990-），男，山東濱州人，碩士。主要從事蠶桑資源及其分子生物學(xué)研究。E-mail：mengstateng@163.com

時(shí)連根，男，教授。E-mail：slgsilk@zju.edu.cn