兔VX2肝癌模型的建立及其影像學(xué)特點(diǎn)

曹雪峰，董國禮

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，四川南充 637000)

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，大多數(shù)不能進(jìn)行早期診斷而喪失手術(shù)機(jī)會(huì)［1］，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療和預(yù)防工作顯得尤為重要。現(xiàn)代影像醫(yī)學(xué)為肝癌的定位、定性、定量、定制治療方案提供了可靠的依據(jù)。兔VX2肝癌動(dòng)物模型與人類原發(fā)性肝癌類似，是肝癌影像診斷及介入治療等研究較為理想的動(dòng)物模型［2］。

1 種植部位的選擇

兔肝左葉位置較固定、表淺，體積明顯大于右葉，且為了避免損傷膽囊或栓塞材料等進(jìn)入膽囊動(dòng)脈引起不必要的并發(fā)，研究兔VX2肝癌模型多選擇將懸液或組織塊種植于肝左葉［3］。Lee等［4］研究表明肝左葉組超選擇置管成功率明顯高于肝右葉組，肝左葉組腫瘤供血?jiǎng)用}直徑粗于肝右葉組，這更加證明了選擇肝左葉種植的優(yōu)越性。

2 兔VX2肝癌模型的建立方法

目前常用的兔VX2肝癌模型的建立方法主要分為瘤細(xì)胞懸液接種法與瘤塊接種法［5］，包括開腹及經(jīng)皮穿刺兩種途徑［6-7］。雖然有學(xué)者報(bào)道在種植兔肝VX2腫瘤細(xì)胞懸液后使用瓊脂糖封堵針孔有效減少了腫瘤的異位種植［7-8］，但瘤細(xì)胞懸液無論經(jīng)何種途徑種植均不可避免的引起腫瘤異位種植，且造價(jià)昂貴、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，目前逐步被瘤組織塊接種法所代替。瘤組織塊接種法包括經(jīng)皮肝穿刺瘤組織塊注入法、開腹直視下瘤組織塊注入法、開腹直視下肝組織內(nèi)包埋法。經(jīng)皮肝穿刺瘤組織塊注入法較少應(yīng)用。國內(nèi)學(xué)者曾報(bào)道開腹直視下瘤組織塊注入法和開腹直視下肝組織內(nèi)包埋法的成瘤率無明顯差異［9］。

2.1 開腹直視下瘤組織塊種植

2.1.1 模型制作的方法 ①開腹直視下肝組織內(nèi)包埋法:實(shí)驗(yàn)兔全麻后仰臥位固定，上腹部術(shù)區(qū)脫毛，常規(guī)消毒鋪巾，無菌條件下取劍突下偏左1 cm處逐層開腹，暴露肝臟，鹽水紗布保護(hù)下用鑷子將肝左葉輕輕拉出體外，選擇肝左葉較厚處用眼科鑷刺破入肝內(nèi)1 cm形成竇道，將備用瘤塊2～3塊植入竇道底部，并用明膠海綿填塞竇口。確認(rèn)無出血后回納肝臟，逐層關(guān)腹。②開腹直視下瘤塊注入法:開腹同①，通過腹部切口將0.1 mL瘤組織塊懸液注入肝左內(nèi)葉包膜下實(shí)質(zhì)內(nèi)［10］，拔針后立即用大小約為1 cm×1 cm明膠海綿塊壓迫約20 s后回納肝臟，逐層關(guān)腹。

2.1.2 模型制作的注意事項(xiàng) 首先，要盡量做到無菌操作及術(shù)后抗感染治療;其次，取出瘤塊后，應(yīng)選取邊緣生長旺盛呈魚肉樣組織，并盡量除去肌肉及壞死組織。開腹直視下肝組織內(nèi)包埋法以明膠海綿填塞竇口，既可避免瘤塊溢出造成腹腔種植，又可使瘤塊種植在靠近較大血管支的肝左葉深部以易于獲得血供。而開腹直視下瘤塊注入法種植，要求注入瘤塊時(shí)進(jìn)針在肝左葉深部，同樣達(dá)到使瘤灶易于獲得血供的目的［4］。

2.2 經(jīng)皮肝穿刺瘤組織塊注入法

2.2.1 模型制作的方法 實(shí)驗(yàn)兔禁食8 h以上，全麻后仰臥位固定，術(shù)野剪毛，B超或CT掃描實(shí)驗(yàn)兔肝臟，確定接種部位為肝左葉，并標(biāo)記穿刺點(diǎn)，消毒鋪巾，刀尖挑開穿刺點(diǎn)皮膚，B超或CT引導(dǎo)穿刺針到達(dá)設(shè)定位置，固定針鞘，拔出針芯，緩慢注入VX2腫瘤組織塊或瘤組織塊懸液，然后將明膠海綿碎塊置入針鞘內(nèi)推送填塞竇口。楊國華等［11］用1 mL的瓊脂糖凝膠封堵進(jìn)針口，有效防止了瘤塊脫離至腹腔或殘留于皮下各層組織。確定接種成功后拔出針具，局部壓迫止血。陳松旺等［12］實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺瘤組織塊接種組成瘤體積大于組織塊懸液接種，因此應(yīng)更多選用組織塊穿刺注入。

2.2.2 模型制作的注意事項(xiàng) 首先，為提高穿刺接種成功率，要求準(zhǔn)確測量穿刺點(diǎn)、穿刺的角度及深度，并注意避開血管和膽管。其次，進(jìn)針要求快，防止瘤塊接種于肝葉之間的空隙中［12］;注射器回吸，體會(huì)有無負(fù)壓，并觀察有無膽汁及血液成分;注射過程要慢，壓力盡可能小。最后，操作過程中注意無菌紗布反復(fù)擦拭針體，確保針體未黏附腫瘤細(xì)胞。

2.3 瘤組織塊接種法制作模型比較

開腹直視下瘤組織塊包埋法具有較高的成瘤率及原位種植率，但需要一定的外科手術(shù)技術(shù)和無菌條件。而采用直視下瘤組織塊注入法則明顯減小了手術(shù)切口，縮短了手術(shù)時(shí)間，對兔肝臟創(chuàng)傷較小，且減少了切口出血及腹壁粘連、感染的幾率，但經(jīng)注射器推注或用導(dǎo)絲推送腫瘤組織塊等方法，易致瘤塊進(jìn)入肝動(dòng)脈或門靜脈而形成肝內(nèi)播散或早期轉(zhuǎn)移，魯東等［13］選用了經(jīng)皮肝穿擴(kuò)展鞘管代替穿刺針，斜行鈍性刺破肝臟后以針芯推入瘤塊及明膠海綿條，可確保瘤塊大小并完全避免了因穿刺而導(dǎo)致的肝臟破裂出血，并使瘤塊種植于肝葉深部而易于獲得血供，保證了模型制作的成功率。

相較于開腹制模，采用超聲或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺組織塊注射法復(fù)制出的兔VX2肝癌模型無開腹接種法常伴的出血多、損傷大、易麻醉意外致動(dòng)物死亡等缺點(diǎn)，且具有接種簡便、創(chuàng)傷小及并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)。Lee等［14］報(bào)道在超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺注射瘤組織塊組和開腹組的成功率均為100%，但是前者腫瘤的種植率為20.8%，而后者為8.3%，Shi等［15］采用CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺瘤組織塊法建立兔VX2肝癌模型(前期9只、后期20只)，成瘤率分別為81.9%、95%。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)研究均表明，經(jīng)皮穿刺瘤組織塊接法種腫瘤同樣具有較高成功率高，可取代剖腹手術(shù)肝腫瘤接種建立兔VX2肝癌模型。

3 兔VX2肝移植瘤的影像學(xué)特點(diǎn)

3.1 在CT上影像學(xué)特點(diǎn)

CT是肝臟疾病的最主要的影像學(xué)檢查方法，目前應(yīng)用的多層螺旋CT，因其具備掃描速度快、分辨率高、薄層重建等多種特點(diǎn)，明顯提高了小病灶、早期癌癥及小血管病變等疾病的檢出敏感率與診斷率，且可對病灶的變化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測。結(jié)合CT多期對比劑增強(qiáng)掃描，可確定腫瘤生長的位置、大小、形狀、血供情況及中心有無壞死，用以區(qū)分病灶的良惡性、評價(jià)腫瘤血管及對療效的反應(yīng)。兔VX2肝腫瘤在接種成活后呈指數(shù)性生長，1周左右時(shí)較小，CT難以顯示。2～3周生長最旺盛，體積迅速增大，切面呈實(shí)質(zhì)性，腫瘤組織塊邊緣有大量新生血管生成，在CT平掃上表現(xiàn)為邊緣欠清晰的低密度，少數(shù)為等密度，CT增強(qiáng)掃描動(dòng)脈期腫瘤邊緣明顯環(huán)狀強(qiáng)化，強(qiáng)化環(huán)多數(shù)不完整且厚薄不均，瘤體中心呈低密度灶，瘤灶與周圍肝實(shí)質(zhì)分界清楚，門脈期腫瘤呈低密度，周圍正常肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化明顯。3～4周腫瘤逐漸增大，中心呈典型的低密度壞死灶，周圍強(qiáng)化環(huán)不明顯。應(yīng)用動(dòng)態(tài)CT研究動(dòng)物肝癌模型中血管隨著時(shí)間推移的發(fā)展變化情況，可以量化腫瘤生長的動(dòng)態(tài)變化，并應(yīng)用到為臨床及研究用途的灌注功能成像中［16］。隨著近年來CT灌注成像的進(jìn)一步完善，通過對肝臟病變血流灌注改變的研究，可用于鑒別良惡性腫瘤，并可評估腫瘤放、化療的療效，可先于影像形態(tài)學(xué)的變化更準(zhǔn)確地判斷腫瘤療效［17］。

3.2 在MRI上影像學(xué)特點(diǎn)

MRI掃描具有多參數(shù)成像及任意平面成像等優(yōu)點(diǎn)，對正常和病理狀態(tài)下的軟組織有良好的對比度，常規(guī)T2WI圖像上可清晰顯示瘤灶，且MRI對瘤灶內(nèi)出血、壞死區(qū)的顯示較為敏感，可對其動(dòng)態(tài)變化及治療后隨訪提供更多信息。MRI掃描顯示瘤灶主體呈長T1、短T2信號(hào)，其間可見混雜的短T1、長T2信號(hào)的瘤灶出血區(qū)和長T1、長T2信號(hào)的壞死囊變區(qū)，增強(qiáng)后呈邊緣環(huán)狀強(qiáng)化。彌散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging，DWI)圖像呈明顯高信號(hào)，邊緣顯示清晰，與周圍肝臟組織對比鮮明。DWI在腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、療效評價(jià)及預(yù)測方面展示出廣闊的應(yīng)用前景。動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI)被認(rèn)為是抗腫瘤血管藥物有效性評價(jià)的非常有前景的生物指標(biāo)。磁共振灌注成像(magnetic resonance-perfusion weight imaging，MRPWI)能對組織微循環(huán)的血流灌注變化進(jìn)行定量分析，多用來評價(jià)兔肝 VX2腫瘤的療效［18］。但因MRI掃描成像序列多，掃描時(shí)間長，受兔呼吸運(yùn)動(dòng)影響干擾大，因此應(yīng)特別注意掃描條件的控制。

3.3 在超聲上影像學(xué)特點(diǎn)

超聲檢查是一種無放射性損傷的檢查，肝臟聲像圖可直觀的顯示病變內(nèi)部的回聲特點(diǎn)，可區(qū)別占位性病變?yōu)槟倚浴?shí)質(zhì)性或混合性。并對病灶進(jìn)行定位和測量，然而對于病變的進(jìn)一步定性診斷則常需行CT或MRI檢查。彩色多普勒血流顯像(color doppler flow imaging，CDFI)可以直接觀測到腫瘤內(nèi)血供的動(dòng)態(tài)變化，尤其是彩色多普勒能量圖技術(shù)幾乎不受血流速度、血流方向、聲速探測角度的影響，增強(qiáng)了對血流探測的敏感性，明顯提高對瘤灶的檢出率。超聲造影(contrast enhanced ultrasound，CEUS)因其能夠反映腫瘤組織的血流灌注狀態(tài)而逐漸得到應(yīng)用。超聲檢查實(shí)驗(yàn)兔肝左葉內(nèi)瘤灶呈偏低回聲或等回聲類圓形結(jié)節(jié)，邊界欠清，部分可見腫瘤內(nèi)出現(xiàn)低回聲的液化壞死區(qū)及較高回聲的干酪樣壞死區(qū)，CEUS強(qiáng)化方式呈“快進(jìn)快出”型。直徑＜10 mm的兔肝VX2腫瘤其周邊部血管較內(nèi)部相對豐富，CEUS顯示增強(qiáng)前后腫瘤內(nèi)部血流信號(hào)強(qiáng)度差異無顯著性而腫瘤邊緣則呈顯著性差異［19］，彩色多普勒和能量多普勒可見腫瘤周邊及內(nèi)部血流信號(hào)，表現(xiàn)為以周邊血供為主的粗大血管呈弧形包繞，中央血供少，呈星點(diǎn)狀、短條狀，頻譜多普勒顯示瘤周的血供主要為動(dòng)脈流速曲線，少數(shù)為靜脈流速曲線［8］。

3.4 在DSA上影像學(xué)特點(diǎn)

肝血管造影是一種創(chuàng)傷性檢查，通過觀察血管狹窄、擴(kuò)張、移位等改變對肝膽占位性病變進(jìn)行分析診斷，臨床應(yīng)用較少，目前肝臟的影像學(xué)檢查多采用CT、MRI和超聲。然而肝血管造影在介入性放射學(xué)治療前了解腫瘤的血供情況是非常必要的。兔肝VX2腫瘤DSA顯示:供血的肝左動(dòng)脈擴(kuò)張，非瘤區(qū)肝內(nèi)動(dòng)脈分支血管顯示欠清或不顯示，而腫瘤供血?jiǎng)用}與腫瘤染色顯影清晰，勾畫出腫瘤的大小。腫瘤血管主干被瘤體推壓呈抱拳狀、握掌狀，其外周可見從環(huán)繞的腫瘤主干血管上分出的腫瘤滋養(yǎng)血管繞行腫瘤，從周邊向中心推進(jìn)，形成不同厚度的環(huán)圈形周邊深染、中心相對淡染的腫瘤染色結(jié)節(jié)。分支深入腫瘤內(nèi)部，部分可見“血池征”。

4 組織病理學(xué)表現(xiàn)

大體觀察，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)腫瘤呈結(jié)節(jié)狀，灰白色，無包膜，切面呈灰紅色，魚肉狀，質(zhì)地較硬，且與周圍正常肝組織分界清楚，其內(nèi)可見豐富的供瘤血管，隨著腫瘤的生長，瘤體中央?？梢婞S白色或灰黃色壞死液化成分，光鏡下見腫瘤呈浸潤性生長，間質(zhì)分界不清，瘤細(xì)胞排列紊亂、體積大、形態(tài)不規(guī)則，核大而深染，形態(tài)各異，新生毛細(xì)血管豐富。隨時(shí)間的推移，瘤灶內(nèi)間質(zhì)成分漸增多。

5 兔VX2肝癌模型的應(yīng)用

VX2腫瘤細(xì)胞株以其強(qiáng)侵襲轉(zhuǎn)移能力，可在新西蘭大白兔的任何內(nèi)臟、骨骼及軟組織生長，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙蟮牟煌?，可以采用不同方法建立兔VX2肝癌模型，用以進(jìn)行肝腫瘤的影像診斷學(xué)及治療學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究。種植2周后，腫瘤生長旺盛，適合進(jìn)行腫瘤治療學(xué)研究，可用MRI檢測術(shù)前及術(shù)后腫瘤生長情況，而用CT檢測術(shù)后碘油栓塞的情況則更為理想;3周后腫瘤中心出現(xiàn)變性壞死，可作為進(jìn)展期肝癌研究模型，而此階段可獲得較為豐富的影像學(xué);4周后可有肝、肺及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，宜作為晚期肝癌動(dòng)物模型研究。近年來，很多學(xué)者進(jìn)一步完善了兔VX2肝癌模型，并應(yīng)用兔VX2肝癌模型進(jìn)行介入放射學(xué)、腫瘤治療學(xué)、腫瘤影像學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)研究，促進(jìn)了對人類肝癌的診斷及治療［20］。

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