山楂葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷的保護作用機制研究進展

李麗靜，吳曉光，商亞珍△

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床藥學部，河北承德 067000;2.河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學院中藥研究所)

山楂葉總黃酮(Total Flavone of Hawthorn Leaf,TFHL)為中藥材山楂葉[1]提取物中黃酮類化合物的總稱，主要成分為蘆丁、牡荊素、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、槲皮素和金絲桃苷等[2]。TFHL制劑(益心酮)在心血管疾病方面療效肯定[3]，臨床已得到廣泛應(yīng)用。近年來，TFHL對缺血性腦血管疾病的藥理作用研究成為熱點。

腦缺血一定時間恢復(fù)血液供應(yīng)后，其功能不但未能恢復(fù)，卻出現(xiàn)了更加嚴重的腦功能障礙，稱為腦缺血再灌注(Cerebral Ischemia-reperfusion,CIR)損傷。CIR損傷是多種機制參與的一種復(fù)雜病理過程，主要與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性、神經(jīng)水腫、炎性細胞浸潤、細胞凋亡等多種機制有關(guān)[4]。TFHL可顯著改善CIR后動物的神經(jīng)功能障礙，減少神經(jīng)細胞損傷，抑制神經(jīng)元凋亡，減輕腦水腫，減少梗死面積[5]?，F(xiàn)將TFHL對CIR損傷的保護作用機制研究進展綜述如下:

1 抗自由基作用

在CIR損傷中，自由基發(fā)揮著重要作用。腦缺血及再灌注均可產(chǎn)生大量的自由基，隨著這些自由基的聚集，會引發(fā)一系列的分子級聯(lián)反應(yīng)，從而增加血腦屏障的通透性，誘發(fā)腦水腫、出血、炎癥反應(yīng)及細胞死亡。

1.1 抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng) 隨著CIR損傷研究的不斷深入，已經(jīng)證實CIR損傷主要是氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[6]。自由基對組織的損傷主要通過損害細胞膜磷脂分子中不飽和脂肪酸，使之過氧化產(chǎn)生穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)，最終使磷脂結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細胞突變、衰老或死亡，從而使各臟器組織受到嚴重破壞，所以，MDA值的高低間接反映機體細胞受自由基損傷的程度。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是一種金屬蛋白酶，帶負電荷，也是體內(nèi)非常重要的抗氧化酶和氧自由基清除劑，能清除超氧陰離子，保護細胞免受損傷，對機體的氧化與抗氧化平衡起重要作用。腦缺血時，脂質(zhì)過氧化活躍，MDA生成增多，SOD則因消耗而減少，因而SOD活性可間接反映機體清除自由基的能力。目前已肯定，給予成年動物外源性SOD可以顯著減輕這種組織損傷[7]。TFHL能增加CIR動物血清、心、肝、腦組織中的SOD含量，而機體的MDA含量則明顯下降，說明TFHL可通過提高抗氧化酶的活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少氧自由基損傷[8]。

1.2 減輕NO神經(jīng)毒性 以一氧化氮(NO)為代表的活性氮是自由基的重要組成部分，在CIR損傷中作用顯著。一方面，活性氮參與腦缺血后神經(jīng)再生與修復(fù)的調(diào)節(jié)過程;另一方面，活性氮能激活基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMPs)，MMPs作為一大類含2價金屬離子的水解酶，其激活可以降解腦血管及神經(jīng)元細胞外基質(zhì)降解緊密連接蛋白，從而破壞血腦屏障[9]。一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)是合成NO的關(guān)鍵因素。NOS 有3 種亞型:nNOS、eNOS、iNOS。腦缺血初期，eNOS活性升高，進而引起NO生成增多，NO導(dǎo)致缺血區(qū)腦血管擴張，改善缺血區(qū)的血供，從而對缺血腦組織起保護作用[10]。而在腦缺血后期，nNOS和iNOS表達量增多，導(dǎo)致NO大量產(chǎn)生，而此階段增高的NO可參與遲發(fā)神經(jīng)元死亡過程，即誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡[11]。大鼠大腦中動脈閉塞造成急性腦缺血，腦組織中的NO有明顯的升高，而TFHL預(yù)處理組NO的產(chǎn)生明顯減少，說明TFHL可通過減少NO生成，減輕NO神經(jīng)毒性，發(fā)揮對CIR腦組織的保護作用[12]。

1.3 提高乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)活性在缺血、缺氧狀態(tài)下，細胞的能量代謝轉(zhuǎn)為無氧酵解。無氧酵解生成ATP的效率低，使細胞出現(xiàn)能量耗竭。無氧酵解引起腦組織缺血性乳酸酸中毒，細胞Na+-K+泵功能損傷，K+大量外溢，同時，Na+、Cl-及Ca2+大量流人細胞內(nèi)引起細胞損傷;缺血區(qū)乳酸堆積還可引起神經(jīng)膠質(zhì)和內(nèi)皮細胞的水腫和壞死，加重缺血性損害。LDH為細胞內(nèi)的一種酶，能催化乳酸氧化為丙酮酸，TFHL可使缺血腦組織中的LDH活性增加，乳酸含量減少，減少乳酸堆積，減輕酸中毒[13]。

2 對血腦屏障的保護作用

血腦屏障(Blood Brain Barrier，BBB)是機體參與固有免疫的內(nèi)部屏障之一，主要作用是阻擋病原生物和其它大分子物質(zhì)由血循環(huán)進入腦組織和腦室。BBB的組織結(jié)構(gòu)包括腦毛細血管內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接、基膜和周細胞、星型膠質(zhì)細胞終足形成的膠質(zhì)膜和細胞外基質(zhì)。CIR后引起血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，通透性增加，從而引起腦出血和腦水腫。李紅等[14]用線栓技術(shù)建立局灶性CIR損傷模型，觀察大鼠CIR后海馬區(qū)組織的病理變化，發(fā)現(xiàn)實驗前飼喂或靜脈注射過TFHL的大鼠腦含水量明顯輕于模型組，病理形態(tài)學也證實了TFHL對大腦皮層缺血腦組織的破壞具有明顯改善作用，提示THFL對CIR后血腦屏障的完整性起到了保護作用。目前研究表明,CIR后血腦屏障的破壞主要機制為炎癥因子的浸潤、蛋白酶的水解作用，以及水通道蛋白的開放等[15]。

2.1 抑制炎癥反應(yīng)過程 人類星形膠質(zhì)細胞在缺氧時可釋放炎癥介質(zhì)，能夠使人微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細胞間粘附分子等基因表達上調(diào)。白細胞激活介導(dǎo)的微血管損傷在缺血再灌注損傷中起著重要的作用，細胞因子增加、粘附分子表達上調(diào)均可導(dǎo)致白細胞由內(nèi)皮細胞和BBB遷移出去，這樣一來，白細胞的募集可以觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致緊密連接(Tight Junction,TJ)分裂和血腦屏障破壞[16]。王濤等[17]研究發(fā)現(xiàn)，炎性細胞因子，包括TNF-α IL-1β和白細胞介素-8(IL-8)參與了CIR損傷的發(fā)生和發(fā)展過程，且上述炎性細胞因子在血漿中的變化滯后于腦組織。提示CIR損傷后，腦內(nèi)炎性細胞因子主要由腦內(nèi)產(chǎn)生并留存于腦內(nèi)，干預(yù)這些炎性細胞因子將會減輕腦組織缺血再灌注損傷的急性炎癥反應(yīng)。劉俊芳等[18]的研究表明，TFHL對缺血再灌注大鼠腦組織具有明顯保護作用這種保護作用與降低缺血腦組織內(nèi)IL-1β、TNF-α含量密切相關(guān)。THFL可能是通過減少具有趨化作用的炎性介質(zhì)自身合成或釋放，減少BBB的破壞，從而減輕CIR損傷。

2.2 下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達 基質(zhì)金屬蛋白酶是一組降解細胞外基質(zhì)分子的金屬離子依賴性蛋白酶在正常狀態(tài)下，其活性被抑制在較低的水平，在一些生理和病理條件下，其活性明顯增強，參與組織損傷和修復(fù)MMp-9又稱明膠酶B，是目前研究較多的基質(zhì)金屬蛋白酶之一，主要作用于膠原、明膠、彈力蛋白、半乳凝素-3聚集蛋白聚糖、纖維連接蛋白等細胞外基質(zhì)成分。生理條件下，細胞外基質(zhì)成分的合成和降解保持著動態(tài)平衡MMp-9對維持這一動態(tài)平衡發(fā)揮著重要作用。Asahi等[19]就發(fā)現(xiàn)，MMp-9基因敲除大鼠能免受腦缺血和創(chuàng)傷性腦損傷，與普通大鼠相比，MMp-9基因敲除大鼠發(fā)生腦缺血后，BBB破裂和白質(zhì)成分的降解均減少，腦損傷體積也相應(yīng)減少。這項研究結(jié)果也表明，腦缺血病理條件下MMp-9被激活。MMp-9一旦激活，即可通過降解血管基底膜和細胞外基質(zhì)成分使BBB的完整性受到破壞，通透性增加，促進腦水腫的形成[20]及炎性細胞的浸潤，加重梗死范圍，甚至發(fā)生出血性轉(zhuǎn)化。劉瑛琳等[21]的研究結(jié)果顯示TFHL可以使CIR大鼠腦組織MMp-9表達明顯降低，并呈劑量效應(yīng)正相關(guān)，TFHL通過下調(diào)MMp-9表達，減少血管基底膜和細胞外基質(zhì)蛋白降解，使BBB通透性降低減輕腦水腫，減少梗死面積。

3 調(diào)控神經(jīng)細胞凋亡

細胞凋亡是一個自由基因調(diào)控的主動死亡過程，近年來有研究證實，缺血再灌注后腦組織損傷加重是由神經(jīng)細胞凋亡引起的，細胞凋亡決定了最終梗死體積[22]。目前認為，細胞凋亡通過三種途徑:線粒體/細胞色素C途徑、細胞表面死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。張釋雙等[23]的研究結(jié)果表明,大鼠中動脈缺血再灌注后，細胞色素C、Caspase-3陽性細胞在缺血側(cè)皮質(zhì)表達明顯上調(diào)，凋亡細胞亦較多分布于缺血周邊區(qū)，進一步證實了細胞色素C、Caspase-3與凋亡密切相關(guān)。紀影實等[24]研究發(fā)現(xiàn),TFHL可下調(diào)缺血再灌注模型大鼠腦組織壞死區(qū)周圍CytC蛋白的表達，提示TFHL通過抑制線粒體CytC途徑的細胞凋亡起到保護作用。

另外，炎性細胞因子IL-1β和TNF-α可激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(Nunclear transcription Factor kappa-B)，NF-κB是一類能特異性識別結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)二聚體轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB的激活不需要新翻譯出的蛋白進行調(diào)控。因此，可以在第一時間對有害細胞的刺激做出反應(yīng)。Berti等[25]用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)的方法檢測CIR后NF-κ B的活性，發(fā)現(xiàn)通過抑制NF-κ B表達可減少在CIR后的細胞凋亡。由于TFHL可降低缺血腦組織中中IL-1β、TNF-α含量[18]，提示TFHL可能通過抑制IL-1β和TNF-α的合成與釋放而間接抑制NF-κ B的表達，減少細胞凋亡。

4 結(jié)語

綜上所述，TFHL可通過提高體內(nèi)抗氧化酶的活性抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),降低NO毒性,提高乳酸脫氫酶的活力,減少酸中毒,通過抗炎作用和抑制金屬基質(zhì)蛋白酶等保護血腦屏障,調(diào)控神經(jīng)細胞凋亡,作用不同靶點或病程不同階段來發(fā)揮對CIR的腦組織的保護作用。各種機制各自獨立又相互聯(lián)系，如抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可以減少自由基對細胞的損傷，保護血腦屏障;抑制炎癥反應(yīng)過程，在保護血腦屏障的同時也可以減少細胞凋亡等等。隨著研究的不斷深入，更多的調(diào)節(jié)機制將會被發(fā)現(xiàn)，各種機制間的密切聯(lián)系也將進一步闡明，這將為充分開發(fā)、利用山楂葉這種資源豐富、價格低廉、低毒的中藥材提供依據(jù)，為開發(fā)治療CIR損傷藥物提供新的研究方向。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.30.

[2]馬國，蔣學華，黃婷，等.HPLC同時測定山楂葉提取物中5種主要成分[J].華西藥學雜志，2007，22(5):547-549.

[3]鄭前娟，王麗媛，鄭立文.益心酮軟膠囊治療冠心病43例療效觀察[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2008，24(3):296.

[4]韓江全，吳俊雄.腦缺血再灌注損傷機制的研究進展[J].內(nèi)科，2011，6(6):523-526.

[5]紀影實，李紅，曲極冰，等.山楂葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國老年學雜志，2009，11(29):2743-2746.

[6]陳勇，白小紅，陳章，等.腦缺血再灌注損傷自由基的改變及其與腦組織損傷的關(guān)系[J].西南軍醫(yī)，2009，11(3):465-466.

[7]張廷華，李珍花，羅福明，等.外源性超氧化物歧化酶對大鼠腦缺血再灌注保護作用的實驗研究[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2010，28(1):121-122.

[8]吳曉光，郭園園，董榮芳.山楂葉總黃酮預(yù)處理對腦缺血再灌注小鼠腦組織抗氧化酶的影響[J].承德醫(yī)學院學報，2007，24(2):119-121.

[9]沈劍剛.活性氮自由基:腦缺血再灌注損傷過程中引起血腦屏障破壞及調(diào)節(jié)神經(jīng)修復(fù)的雙刃劍[J].生物物理學報，2012，28(4):295-306.

[10]Sehara Y,Hayashi T,Deguchi K,et al.Distrbution of inducible nitric oxide synthase and cell proliferation in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion[J].Brain Res,2006,1093(1):190.

[11]王光偉，豐昀，邱細敏，等.白術(shù)多糖對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后腦水腫的影響及其機制探討[J].中草藥，2009，40(6):948-950.

[12]劉俊芳，連建學，李昌俊，等.山楂葉總黃酮對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用研究[J].中國藥房，2011，22(35):3277-3280.

[13]張曉丹.山楂葉總黃酮對小鼠腦缺血的保護作用研究[J].江西醫(yī)藥，2009，44(9):865-866.

[14]李紅，張爽，紀影實，等.山楂葉總黃酮不同給藥途徑對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國老年學雜志，2012，32(5):995-997.

[15]豐浩榮，許鵬程，徐進步，等.大鼠腦缺血再灌注時水通道蛋白4表達與血腦屏障通透性變化[J].中國應(yīng)用生理學雜志，2010，2(1):12-18.

[16]Ballabh P,Braun A,Nedergaard M.The blood-brain barrier:an overview:structure,regulation, and clinical implications[J].Neurobiol Dis,2004,16(1):1-13.

[17]王濤，文亮，李大江.全腦缺血-再灌注損傷后炎性細胞因子的變化及其意義[J].中國危重病急救醫(yī)學，2000，12(5):290-292.

[18]劉俊芳，李昌俊，鄭瑤，等.山楂葉總黃酮對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的探討[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31(10):832-834

[19]Asahi M,Wang X,Mori T,et al.Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on the proteolysis of blood-brain barrier and white matter components after cerebral ischemia[J]. J Neurosci,2001,21(19):7724-7732.

[20]劉勝達.大鼠腦出血后腦組織MMP2、MMP9 表達及其與腦水腫關(guān)系的研究[J］.實用心腦肺血管病雜志，2007，15(4):249-251．

[21]劉瑛琳，包雪鸚.山楂葉總黃酮對大鼠腦缺血再灌注后基質(zhì)金屬蛋白酶29表達的影響[J].中風與神經(jīng)疾病雜志，2006，6(23):690-691.

[22]Ferrer I,Planas AM.Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia:life and death struggle in the penumbra[J].J Neuropathol Exp Neurol,2003,62(4):329-339.

[23]張釋雙，馬靜萍.粒細胞集落刺激因子對大鼠腦缺血再灌注損傷腦Caspase-3與細胞色素C表達的影響[J].中國神經(jīng)免疫學雜志，2011，18(4):269-272.

[24]紀影實，曲極冰，李紅，等.山楂葉總黃酮對大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡的保護作用[J].吉林大學學報(醫(yī)學版)，2008，34(4):590-593.

[25]Berti R,Williams AJ,Moffett JR,et al. Quantitative real-tim RT-PCR analysis of in fl ammatory gene expression associate with ischemia-reperfusion brain injury[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(9):1068-1079.