利用RAPD技術(shù)對(duì)牡丹江地區(qū)紅松根際土壤微生物多樣性的分析

賈 丹，王 剛，王文帆，陳 迪

(1.黑龍江省森林工程與環(huán)境研究所，哈爾濱150081;2.森林可持續(xù)經(jīng)營(yíng)與環(huán)境微生物工程黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150081;3.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，哈爾濱150081)

土壤是巖石圈表面的疏松表層，是陸生植物生活的基質(zhì)，為植物提供必需的營(yíng)養(yǎng)和水分。植物的根系與土壤有著極大的接觸面，在植物和土壤之間進(jìn)行著頻繁的物質(zhì)交換，彼此有著強(qiáng)烈影響，因此通過(guò)控制土壤因素就可影響植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。而在眾多因素當(dāng)中，土壤微生物因素是最為重要的。

土壤微生物組成復(fù)雜［1］，數(shù)量巨大，種類繁多，一直被認(rèn)為是研究中的黑匣子［2］。其中，土壤中的細(xì)菌和真菌在生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中扮演著非常重要的角色［3－4］，而且對(duì)土壤中有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換也起著至關(guān)重要的作用［5］。土壤微生物還對(duì)地表生態(tài)系統(tǒng)［6］，對(duì)植物的健康［7－8］，土壤的結(jié)構(gòu)［9］，土壤的肥力［10－11］產(chǎn)生重要的影響。

土壤微生物多樣性指生命體在遺傳、種類和生態(tài)系統(tǒng)層次上的變化。它代表著土壤微生物群落的穩(wěn)定性，同時(shí)也反映土壤生態(tài)機(jī)制和土壤脅迫對(duì)微生物群落的影響。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，微生物多樣性豐富的土壤其生態(tài)功能也呈現(xiàn)多樣性，且生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定持續(xù)。因此對(duì)土壤微生物的多態(tài)性及功能的研究會(huì)對(duì)樹(shù)木生理生化的研究及土壤環(huán)境的研究提供依據(jù)。

目前，針對(duì)土壤微生物多樣性的研究，主要為傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)分離的方法、土壤酶活性測(cè)定、生物標(biāo)記及分子生物學(xué)技術(shù)。

隨著人們對(duì)土壤中微生物的原位生存狀態(tài)研究，越來(lái)越發(fā)現(xiàn)常規(guī)的分離培養(yǎng)方法很難全面地估價(jià)微生物群落多樣性。應(yīng)用現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，成功克服了傳統(tǒng)微生物生態(tài)學(xué)研究技術(shù)的局限性。隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD，Random Amplified Polymorphic DNA)是由 Williams和Welsh在1990年同時(shí)提出的一種快速、簡(jiǎn)便、多態(tài)性檢出率高、可自動(dòng)化分析的一項(xiàng)DNA分子標(biāo)記技術(shù)［13－14］。RAPD 建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的基礎(chǔ)上，以一系列人工合成的不同隨機(jī)寡核苷酸序列(l0bp)為引物，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染，或者是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)溴化乙錠(EB)染色來(lái)檢測(cè)。RAPD技術(shù)以檢測(cè)多態(tài)性DNA為目的，因快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，其在DNA水平上反映微生物群落的多樣性等方面得到了廣泛的應(yīng)用，此外也可用于物種分類和親緣關(guān)系鑒定、基因組分析等方面。

紅松(Pinus koraiensis)是我國(guó)東北山地的地帶性頂級(jí)植被類型——紅松闊葉林的優(yōu)勢(shì)樹(shù)種。紅松因其樹(shù)體高大通直，材質(zhì)優(yōu)良而具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。最近研究表明紅松的自然分布呈下降趨勢(shì)，且土壤微生物功能多樣性正朝著不利于紅松更新的方面進(jìn)行。研究紅松土壤根際微生物多樣性，可以揭示紅松林土壤結(jié)構(gòu)和肥力等信息，有助于改善紅松林土壤條件，從而更好地保護(hù)紅松［15－16］。

1 研究區(qū)域概況及土壤樣品的采集

研究區(qū)域?yàn)槟吕饪h，海拔高度在400m左右，地勢(shì)多為丘陵漫崗，年平均氣溫2.3℃。平均降水量500～550mm，主要集中在6、7、8三個(gè)月。地帶性土壤為暗棕壤。森林植被以中溫帶針葉——闊葉混交林，以紅松為代表樹(shù)種，除紅松外還分布著云杉、冷杉、楓樺、椴樹(shù)和蒙古櫟等。林下灌木以毛榛子、胡枝子、榛柴、刺玫果和馬林等為主。多年生草本植物以小葉樟為主，伴生有野豌豆、草玉梅和銀蓮子等。

在實(shí)驗(yàn)區(qū)范圍內(nèi)共取了3種林型，分別為椴樹(shù)紅松林、云冷杉紅松林和蒙古櫟紅松林，且每種林型中又選取了幼齡、中齡和成熟林共9塊樣地。

在每一個(gè)林分內(nèi)設(shè)置(20×20)m2的樣地，并將其按照對(duì)角線分為四個(gè)小樣地，在每個(gè)小樣地挖土壤剖面至母質(zhì)層。用土壤環(huán)刀在紅松根際取3個(gè)平行土樣，放入冰箱4℃ 冷藏保存。

2 試驗(yàn)方法

由于RAPD基于PCR反應(yīng)，所以PCR反應(yīng)體系以及PCR擴(kuò)增程序的確立尤為重要。本試驗(yàn)通過(guò)查閱鄭成木［17］及曹立成［18］等相關(guān)文獻(xiàn)，主要對(duì)退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了退火溫度為38℃。具體試驗(yàn)反應(yīng)體系如下:

表1 具體試驗(yàn)反應(yīng)體系Tab.1 Specific test reaction

3 結(jié)果與分析

3.1 RAPD－PCR產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果

取8μL PCR產(chǎn)物與6×加樣緩沖液充分混合后，點(diǎn)入TAE為緩沖液的1%的瓊脂糖凝膠中，同時(shí)點(diǎn)入DL2000 Marker進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)PCR結(jié)果。其結(jié)果如圖1所示。圖1中，標(biāo)準(zhǔn)物為DL2000，1～3道分別為椴樹(shù)紅松林幼齡林、中齡林及老齡林。4～6道為蒙古櫟紅松林幼齡林、中齡林及老齡林。7～9道為云冷杉紅松林幼齡林、中齡林及老齡林。且按電泳結(jié)果順序?qū)⑸鲜?塊樣地編為1#～9#。

圖1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RAPD amplification result

由圖1中顯示，1～3泳道中得到的的條帶最豐富，其次為7～9泳道，4～6泳道條帶最少。由此可以說(shuō)明，椴樹(shù)紅松林中林木根際土壤微生物的多態(tài)性最為豐富，云冷杉紅松林其次，蒙古櫟紅松林最底。

3.2 RAPD數(shù)據(jù)分析

電泳圖譜中的每一條譜帶均代表了引物與模板DNA互補(bǔ)的一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)，記為一個(gè)分子標(biāo)記。根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照反應(yīng)產(chǎn)物在膠片上的對(duì)應(yīng)位置，對(duì)同一引物不同模板的電泳結(jié)果進(jìn)行分析。所有模板都具有的帶為公共帶，表示無(wú)多態(tài)性;其余為多態(tài)帶，表示有多態(tài)性。有帶記為1，無(wú)帶記為0，形成0/1矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。用 NTSYS－pc(version 2.10)軟件包中的Nei＆Li法的計(jì)算方法分別計(jì)算遺傳相似系數(shù)。用UPGMA法聚類分析，用NJTREE程序構(gòu)建樣本間的樹(shù)狀聚類圖。

用上訴分析方法得到遺傳系數(shù)表(見(jiàn)表2)和聚類分析圖(如圖2所示)。

表2 RAPD遺傳相似性分析Tab.2 RAPD genetic similarity analysis

由表2可知，椴樹(shù)紅松林的幼齡林與中齡林和老齡林的遺傳系數(shù)分別為0.92和1.00，中齡林與老齡林的遺傳系數(shù)為0.92;蒙古櫟紅松林幼齡林與中齡林和老齡林的遺傳系數(shù)為0.83和0.83，中齡林與老齡林的遺傳系數(shù)為0.83;云冷杉紅松林幼齡林與中齡林和老齡林的遺傳系數(shù)為0.75和0.75，中齡林與老齡林的遺傳系數(shù)為0.83。

由聚類圖2可知;蒙古櫟紅松林中4#、5#、6#在遺傳系數(shù)為0.83時(shí)聚成一類;椴樹(shù)紅松林的1#與3#遺傳系數(shù)完全相同，而與2#在遺傳系數(shù)為0.92時(shí)聚成一類;云冷杉紅松林中8#與9#在遺傳系數(shù)為0.83時(shí)聚成一類，而與7#在遺傳系數(shù)在0.75時(shí)聚成一類。

由聚類分析可知，三種林型在幼齡林階段的1#椴樹(shù)紅松林與7#云冷杉紅松林在遺傳距離為0.58時(shí)聚成一類，而與4#蒙古櫟紅松林在遺傳距離0.33時(shí)聚成一類。中齡林階段的2#椴樹(shù)紅松林與8#云冷杉紅松林在遺傳距離為0.58時(shí)聚成一類，而與5#蒙古櫟紅松林在遺傳距離為0.33時(shí)聚成一類。成熟林階段的3#椴樹(shù)紅松林與9#云冷杉紅松林在遺傳距離為0.58聚成一類，而與6#蒙古櫟紅松林在遺傳距離0.33時(shí)聚成一類。

4 結(jié)論

從以上分析得出結(jié)論:椴樹(shù)紅松林根際土壤微生物的多態(tài)性大于云冷杉紅松林，云冷杉紅松林大于蒙古櫟紅松林。3種林型內(nèi)的土壤微生物是相互獨(dú)立變化的，總體趨勢(shì)大致相同。椴樹(shù)紅松林與云冷杉紅松林的土壤微生物構(gòu)成較為近似，與蒙古櫟紅松林的土壤微生物結(jié)構(gòu)較遠(yuǎn)。椴樹(shù)紅松林在幼齡林時(shí)期向中齡林過(guò)渡時(shí)，土壤微生物結(jié)構(gòu)有細(xì)微的變化，到成熟林時(shí)又恢復(fù)至幼齡林時(shí)期的水平。蒙古櫟紅松林在三個(gè)時(shí)期都在變化，變化的趨勢(shì)較無(wú)規(guī)律。云冷杉紅松林在中齡林和成熟林階段土壤微生物的構(gòu)成較為相似，與幼齡林時(shí)期相差較大。

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