離體頸動脈竇壓力感受器研究方法的改進(jìn)
——竇內(nèi)壓的自動控制*

魏 華，趙海燕，劉 萍，黃海霞，王 偉△，付小鎖，鈕偉真

（1．首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗與測試中心，北京100069；2．首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院生理教研室，北京101300；3．首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，北京100069）

壓力感受器的機-電換能機制是減壓反射研究的重點之一，其中感受壓力變化的機械敏感離子通道的本質(zhì)仍不清楚［1］。壓力感受器的放電活動直接與血管壓力感受野的機械變形有關(guān)，而后者主要取決于主動脈弓或頸動脈竇區(qū)的壓力。因此，準(zhǔn)確控制主動脈弓或頸動脈竇內(nèi)的壓力是完成實驗的關(guān)鍵之一。本實驗室近年來成功地將壓力鉗理念引入離體心臟機械-電反饋研究［2］，根據(jù)同樣原理，本實驗以壓力調(diào)節(jié)閥為主要部件，構(gòu)建了一套計算機化的竇內(nèi)壓力控制系統(tǒng)。

1 材料與方法

1．1 頸動脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本的制備和灌流

實驗采用成年家兔，體重（2．0±0．3）kg，雌雄不拘，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供。20%氨基甲酸乙酯（5 ml／kg）靜脈麻醉，做氣管插管。于動物頸部正中切口游離一側(cè)頸動脈竇區(qū)和竇神經(jīng)，取出頸動脈竇-竇神經(jīng)（carotid sinus-carotid sinus nerve，CS-CSN）標(biāo)本（圖 1），標(biāo)本包括頸總動脈長約7 mm、頸外動脈約5 mm、頸內(nèi)動脈約5 mm（結(jié)扎）和竇神經(jīng)約 7 mm［3］。

應(yīng)用本室自制的離體標(biāo)本灌流-放電記錄裝置（圖1），對CS-CSN標(biāo)本從血管內(nèi)外兩條途徑同時灌流。灌流液（mmol／L）：NaCl 154，KCl 4．7，CaCl22．2，MgCl21．1，glucose 5．5，用 HEPES-NaOH調(diào) pH為 7．4，持續(xù)用純氧平衡（以抑制頸動脈體化學(xué)感受器的放電），溫度保持在36℃～37℃。

Fig．1 Carotid sinus perfusion-discharge recording apparatus CS-CSN preparation was mounted in a temperature-controlled bath and perfused outside and inside carotid sinus with the same solution．Carotid sinus nerve was placed on the electrode to record the baroreceptor discharge CS-CSN：Carotid sinus-carotid sinus nerve

1．2 竇內(nèi)壓力的控制

首先，根據(jù)實驗需求，按 pClamp7．0軟件（Axon Instrument，USA）規(guī)定的格式，預(yù)先編輯壓力控制文件，設(shè)定壓力波形、時程、強度等參數(shù)。實驗過程（圖2）中，壓力控制文件由pClamp 7．0軟件運行，再通過Digidata1200（Axon Instrument，USA）進(jìn)行 D／A轉(zhuǎn)換，生成壓力控制指令（即與壓力控制文件相對應(yīng)的電壓信號），壓力調(diào)節(jié)閥（PRE-U，Hoerbiger，Deutschland）收到該指令后調(diào)節(jié)高壓氣源（純氧，0．15 MPa）的流量，輸出預(yù)定的壓力，該壓力輸至盛有灌流液的密閉容器，驅(qū)動灌流液進(jìn)入頸動脈竇內(nèi)和控制竇內(nèi)壓力。本系統(tǒng)還將壓力換能器（YH-4，國產(chǎn)）置于竇內(nèi)灌流出口處，以監(jiān)測竇內(nèi)壓是否與指令壓力一致。

Fig．2 Carotid sinus perfusion-pressure control system Pressure stimulus files were edited according to experimental requirements in advance．They were run by pClamp7．0 and conversed to corresponding voltage signals（pressure commands）via Digidata1200．The pressure controlling valve followed the command and then output prospective pressure．The pressure output drove the solution into the carotid sinus and controlled the intrasinus pressure CS-CSN：Carotid sinus-carotid sinus nerve

2 結(jié)果

2．1 多種壓力控制模式的實現(xiàn)

2．1．1 脈動式壓力控制模式 脈動式壓力是頸動脈竇經(jīng)常感受到的生理性壓力刺激，在實驗中常被采用。本實驗用三角波形的壓力指令（圖3B）模擬脈動式壓力模式，通過本系統(tǒng)可輸出相應(yīng)的竇內(nèi)壓力（圖3A）。和壓力指令相比，輸出壓力的峰值和谷值存在誤差（＜3 mmHg），升支的起始段和降支的終末段也有一定變形，但對于壓力感受器的研究沒有影響。

Fig．3 Comparison between carotid sinus pressure and pulsation pressure commandA：CSP，carotid sinus pressure；B：Pulsation pressure command（pulsation period：0．6 s，minimal pressure：80 mmHg；top pressure：120 mmHg，110 mmHg，90 mmHg）

2．1．2 斜坡式壓力控制模式 為測定壓力感受器若干特征參數(shù)，在實驗中常需應(yīng)用勻速升高的斜坡式壓力控制模式。系統(tǒng)輸出的斜坡式壓力的上升速率和最高壓力與壓力指令基本相同（圖4），盡管在0～20 mmHg沒有形成壓力波（圖4A）（可能與壓力調(diào)節(jié)閥的啟動惰性有關(guān)），由于竇神經(jīng)放電所需壓力的閾值遠(yuǎn)大于20 mmHg，所以不影響實驗效果。另外，輸出壓力的下降速率較慢，與壓力指令有明顯差別，但因這部分壓力波形與壓力感受器特征參數(shù)的測定無關(guān)。

Fig．4 Comparison between carotid sinus pressure and ramp pressure commandA：Carotid sinus pressure；B：Ramp pressure command（from 0 mmHg to 200 mmHg at a constant speed of 20 mmHg／s

2．1．3 階躍式壓力控制模式 階躍式壓力波形也是動脈壓力感受性反射研究中常用的壓力刺激模式，尤其在研究動脈壓力感受器的適應(yīng)性時常被采用。本系統(tǒng)也可輸出較理想的階躍式壓力波形。每次竇內(nèi)壓力階躍的時間、數(shù)值與指令文件基本一致（圖5），只是在階躍初期有輕微波動，但持續(xù)時間很短，之后的壓力能很穩(wěn)定地維持在相應(yīng)水平，直至下一次階躍指令到達(dá)。因此，本系統(tǒng)生成的階躍式壓力控制模式完全能滿足實驗需求。

Fig．5 Comparison between carotid sinus pressure and step pressure commandA：Carotid sinus pressure；B：Step pressure command（from 50 mmHg to 190 mmHg at 20 mmHg／step）

2．2 不同壓力條件下頸動脈竇的放電

圖6A為應(yīng)用脈動式壓力控制模式時的竇神經(jīng)少纖維放電，顯示了竇神經(jīng)纖維放電與壓力變化之間的關(guān)系。圖6B為斜坡式壓力刺激時的竇神經(jīng)少纖維放電，從中可以得到竇神經(jīng)壓力-放電頻率關(guān)系曲線，有利于進(jìn)一步分析頸動脈竇壓力感受器的各個特征參數(shù)和研究壓力換能器機-電換能過程的離子通道機制。圖6C是階躍式壓力控制模式下的竇神經(jīng)少纖維放電，這種情況可以用來研究動脈壓力感受器的適應(yīng)性。

3 討論

壓力感受器是分布于主動脈弓和頸動脈竇血管外膜下的感覺神經(jīng)末梢，其主要功能是將動脈內(nèi)壓力信息轉(zhuǎn)變?yōu)橄蛑袠袀魉偷碾娦盘?，即機-電換能作用。壓力感受器的機電換能機制是減壓反射研究的重點之一，但其中機-電換能過程中的諸多細(xì)節(jié)均不清楚［1］。目前，了解動脈壓力感受器機電換能機制的的重要方法之一是研究壓力感受器地壓力-放電關(guān)系。因此，準(zhǔn)確控制主動脈弓或頸動脈竇內(nèi)的壓力是完成實驗的關(guān)鍵之一。

Fig．6 Discharges of carotid sinus nerve under diverse pressure moods SND：Sinus nerve discharge；CSP：Carotid sinus pressure．Discharges of carotid sinus nerve under pulsation pressure mode（A），ramp pulsation pressure mode（B）and step pressure mode（C）

以往本實驗室利用蠕動泵動力的脈動性質(zhì)實現(xiàn)對頸動脈竇的脈動式灌流，并通過手動調(diào)節(jié)灌流阻力的方式控制竇內(nèi)的平均壓力。采用這種方法很難準(zhǔn)確控制脈動壓力的幅度，也無法輸出長時間的方波或斜坡壓力刺激，無法精確分析壓力感受器的各項指標(biāo)（如閾值壓力、最大放電頻率、飽和頻率、壓力-頻率關(guān)系曲線等），致使研究難于深入。有文獻(xiàn)報道利用計算機或單片機等實現(xiàn)竇內(nèi)壓力的精確調(diào)節(jié)［4］，并可實現(xiàn)斜坡式、脈動式等多種形式的壓力刺激，但市場上并無現(xiàn)成的設(shè)備。

本室近年來成功地將壓力鉗技術(shù)引入離體心臟機械-電反饋研究［2］，根據(jù)同樣原理，本實驗選用壓力調(diào)節(jié)閥為主要部件，首次成功地構(gòu)建了這套計算機化的竇內(nèi)壓力控制系統(tǒng)。壓力調(diào)節(jié)閥是本系統(tǒng)的核心部件，閥中的關(guān)鍵元件——壓電陶瓷片在電壓（即壓力控制指令）的作用下控制閥門的開啟和關(guān)閉。另外，閥內(nèi)內(nèi)置的壓力傳感器實時檢測實際壓力輸出，并將其輸入給內(nèi)置的負(fù)反饋放大器。當(dāng)輸出壓力低于指定壓力時，進(jìn)氣閥門開放，使輸出壓力上升；而當(dāng)輸出壓力高于指定值，進(jìn)氣閥門關(guān)閉、排氣閥門打開，輸出壓力下降。如此實現(xiàn)對壓力的準(zhǔn)確鉗制。

實際應(yīng)用的結(jié)果表明［5］，本系統(tǒng)一方面為頸動脈竇竇內(nèi)灌流提供驅(qū)動力，同時能對頸動脈竇壓力感受器施加程控化、多種波形的壓力刺激。這套壓力控制系統(tǒng)的建立為深入研究壓力感受器了提供準(zhǔn)確靈活的壓力刺激方法。

［1］ Chapleau MW，Abboud FM．The baroreceptor reflex：novel methods and mechanisms［M］．USA，Kluwer Academic Publishers，2004．1-20．

［2］ Wei H，Huang H X，Wang W，et al．A ventricular pressure-clamping system for the study of mechano-electrical feedback［J］．Acta Physiologica Sinica，2006，58（6）：606-610．

［3］ 鈕偉真，劉東霞．心血管生理學(xué)與臨床［M］．北京：高教出版社，2004．568-571．

［4］ 易小林，王敏彥，何瑞榮，等．單片機控制的頸動脈竇區(qū)自動灌流系統(tǒng)的研究［J］．中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2001，17（3）：308-310．

［5］ 劉廷會，魏 華，鈕偉真，等．芐阿米洛利和釕紅對頸動脈竇壓力感受器放電的阻斷作用［J］．首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，32（2）：218-223．