斑馬魚(yú)長(zhǎng)時(shí)記憶缺陷突變體的篩選*

李心樂(lè)，孫 磊，何寧寧，張華鋒，陳冬艷

（南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院模式動(dòng)物與退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病天津市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071）

學(xué)習(xí)和記憶是人類和動(dòng)物精神生活中最為復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。學(xué)習(xí)是在經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上改變行為反應(yīng)的過(guò)程，記憶是從學(xué)習(xí)到信息貯存和讀出的過(guò)程。記憶根據(jù)持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短分為長(zhǎng)時(shí)記憶和短時(shí)記憶。通常認(rèn)為長(zhǎng)時(shí)記憶需要新的蛋白合成和新的突觸生長(zhǎng)，即意味著長(zhǎng)時(shí)記憶的建立需要新基因的表達(dá)；而短時(shí)記憶是對(duì)已有蛋白進(jìn)行共價(jià)修飾來(lái)改變已有突觸［1］。

遺傳篩選是發(fā)現(xiàn)新基因以及研究基因功能的一個(gè)非常有效的方法。在果蠅drosophila中利用行為學(xué)和正向遺傳的方法篩選已經(jīng)獲得四個(gè)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的突變體，即 dunce，rutabagae，amnesiac和 linotte，并利用這些突變體研究學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制。在小鼠中利用反向遺傳學(xué)方法構(gòu)建了小鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的不同突觸可塑性的品系，進(jìn)而分析突觸功能和研究記憶儲(chǔ)存的分子機(jī)制。研究結(jié)果顯示反向遺傳學(xué)是研究記憶相關(guān)機(jī)制的有效途徑，但作為哺乳脊椎動(dòng)物，其中依然存在明顯的問(wèn)題，例如遺傳背景的復(fù)雜性和基因多效性［4］。鑒于小鼠胚胎體內(nèi)發(fā)育，胚仔數(shù)少等特點(diǎn)使得小鼠不適于大通量遺傳學(xué)篩選。所以尋找有效適宜的脊椎動(dòng)物來(lái)進(jìn)行正向遺傳篩選，構(gòu)建相關(guān)的突變體，對(duì)學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)機(jī)制的研究是非常重要的。

斑馬魚(yú)作為新型的脊椎動(dòng)物模型，具有獨(dú)特的優(yōu)越性，如體外受精和發(fā)育、胚體透明、養(yǎng)殖空間小、產(chǎn)卵量大等。斑馬魚(yú)中的正向遺傳篩選能夠分離出在脊椎動(dòng)物中影響學(xué)習(xí)記憶的行為特性的單一基因突變體［5］。斑馬魚(yú)有在遺傳復(fù)雜性和簡(jiǎn)單性上保持了很好平衡的雙倍染色體，而易于在有限空間中進(jìn)行大量養(yǎng)殖，是大通量遺傳篩選的先決條件。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明在硬骨魚(yú)和陸地脊椎動(dòng)物中關(guān)于學(xué)習(xí)和記憶的屬性與神經(jīng)學(xué)基礎(chǔ)是非常相似的［6］。因此，斑馬魚(yú)是脊椎動(dòng)物中進(jìn)行正向遺傳篩選、構(gòu)建學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)突變體的理想動(dòng)物。

在這里我們通過(guò)行為學(xué)方法在化學(xué)物質(zhì)乙基亞硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）誘變的 F1代斑馬魚(yú)中篩選出一例學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的突變體fgt。結(jié)果顯示，與野生型相比，fgt突變體的長(zhǎng)時(shí)記憶有明顯缺陷，其F2代中有近一半成魚(yú)的行為學(xué)和基因表達(dá)異于野生型，可以確定這是一個(gè)顯性的斑馬魚(yú)突變體。

1 材料與方法

1．1 斑馬魚(yú)飼養(yǎng)

野生型斑馬魚(yú)成年AB品系飼養(yǎng)于中國(guó)天津南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院斑馬魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，給予14 h光／10 h暗的光照周期，28．5℃養(yǎng)殖，每日喂2次鮮活豐年蝦。

1．2 ENU誘變

選取4～8月齡的斑馬魚(yú)雄魚(yú)，ENU誘變濃度2．5 mmol／L，處理時(shí)長(zhǎng) 1 h，每周 1次，連續(xù)處理 4周［7］。

ENU處理過(guò)的雄魚(yú)與野生型AB雌魚(yú)交配產(chǎn)生的子代為F1代，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)獲得大約1 400條F1個(gè)體。隨后利用行為學(xué)方法在F1代個(gè)體進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶突變體的篩選。

1．3 行為學(xué)篩選

使用抑制逃避反應(yīng)來(lái)對(duì)F1個(gè)體進(jìn)行行為學(xué)篩選。建立抑制逃避反應(yīng)裝置（圖1），以電擊的方式進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練，以及24 h后的無(wú)電擊記憶測(cè)試［8］。

Fig．1 Schematic representation of inhibitory avoidance plastic tankThe 18 cm×9 cm×7 cm tank have dark and white compartments separated by a sliding partition．Compartments were defined by plastic self-adhesive film in black or white colors．Two wire electrodes extending through each opposing side wall on the dark compartment were attached to a manually operated electric stimulator

為了找一種比較穩(wěn)定的學(xué)習(xí)記憶方式，我們對(duì)電擊方式進(jìn)行了探索，改變電擊的持續(xù)時(shí)間或者反復(fù)電擊及重復(fù)電擊相隔的時(shí)間。同時(shí)我們監(jiān)控了電擊對(duì)斑馬魚(yú)生理的影響，發(fā)現(xiàn)選取的電壓強(qiáng)度和時(shí)間的電擊對(duì)斑馬魚(yú)的正常游動(dòng)和身體狀況沒(méi)有影響。

1．4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

于學(xué)習(xí)刺激前一天將斑馬魚(yú)從養(yǎng)殖系統(tǒng)中取出，置于白色正方形容器（6 cm×6 cm×6 cm）中，次日將斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)入抑制逃避反應(yīng)裝置中，自由活動(dòng)3 min，隨后進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練，激活學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)基因的表達(dá)，然后將魚(yú)放回白色正方形容器。在放置不同的時(shí)間后，迅速將魚(yú)放入冰上冷卻致死，分離出斑馬魚(yú)端腦，提取端腦RNA，進(jìn)行qRT-PCR。

實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃，2min預(yù)變性，然后按94℃，30 s，62℃，30 s，72℃，30 s共做40個(gè)循環(huán)，最后72℃，5 min延伸。

引物序列包括：β-actin，上游引物：5′TTCACCACCACAGCCGAAAGA3′，下游引物：5′TACCGCAAGATTCCATACCCA3′；c-fos，上游引物：5′TACCCGCTCAACCAGACTCA3′，下游引物：5′GTCTTTGCTCCAG TAACCCTCA3′。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)均采用SPSS12．0軟件進(jìn)行。差異性檢驗(yàn)均采用兩樣本 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 野生型斑馬魚(yú)的黑色傾向性

將斑馬魚(yú)輕柔放在逃避抑制裝置的白色區(qū)域，打開(kāi)隔板使他們可以在兩個(gè)區(qū)域之間自由的游動(dòng)，在裝置中自由活動(dòng)5 min，并且記錄在每部分所停留的時(shí)間。斑馬魚(yú)在裝置中自由游動(dòng)5 min，其停留在黑色區(qū)域的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于停留在白色區(qū)域的時(shí)間（P＜0．01），表明斑馬魚(yú)對(duì)黑色具有明顯的傾向性（圖 2）。

Fig．2 Dark preference of zebrafish（n＝40）White：Time spent on white compartment；Black：Time spent on black compartment**P＜0．01 vs white group

2．2 斑馬魚(yú)在抑制逃避電擊后的穩(wěn)定的長(zhǎng)時(shí)記憶

在知曉斑馬魚(yú)對(duì)黑色區(qū)域具有傾向性之后，我們使用一批新的斑馬魚(yú)開(kāi)始對(duì)抑制逃避的電擊條件的探索。為了能得到穩(wěn)定的長(zhǎng)時(shí)記憶，通過(guò)改變電擊的持續(xù)時(shí)間（10 s，20 s，30 s）或者反復(fù)電擊（10 s×3，20 s×3），及重復(fù)電擊相隔的時(shí)間（30 min，1 h，2 h）。我們發(fā)現(xiàn)反復(fù)短時(shí)間電擊以及較短的電擊相隔時(shí)間是能夠得到魚(yú)的比較高效記憶方法。最后設(shè)定的電擊訓(xùn)練方案是重復(fù)電擊10 s 3次，30 min后再次電擊10 s 3次。在此條件下，在3 min的自由活動(dòng)時(shí)間中，野生型AB斑馬魚(yú)（n＝40）學(xué)習(xí)訓(xùn)練時(shí)在白色區(qū)域停留的時(shí)間與電擊后測(cè)試時(shí)在白色區(qū)域停留的時(shí)間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01），表明24 h后斑馬魚(yú)的長(zhǎng)時(shí)記憶是存在的（圖3）。

在40條AB中只有1條魚(yú)在白色區(qū)域停留的時(shí)間在90 s以下，其概率約為2．5%，這個(gè)概率用來(lái)篩選ENU突變體是比較可靠的。所以，設(shè)定篩選突變體的標(biāo)準(zhǔn)定在白色區(qū)域停留的時(shí)間小于90 s，通過(guò)對(duì)候選突變體（在白色區(qū)域停留時(shí)間小于90 s）的重復(fù)測(cè)試來(lái)確定突變體。

Fig．3 Long-term memory of zebrafish（n＝40）Training：Time spent in white compartment during 3 min inhibitory avoidance task when learning training in zebrafish；Test：Time spent when memory test after shock in zebrafish**P＜0．01 vs training group

2．3 ENU誘變后 F1代突變體的篩選

利用抑制逃避裝置在上述訓(xùn)練方案下對(duì)約1 400條ENU誘變的F1代成魚(yú)進(jìn)行行為學(xué)篩選，獲得一例候選突變體。該突變體的7次重復(fù)3 min抑制逃避記憶測(cè)試結(jié)果分別是81 s，52 s，52 s，63 s，43 s，78 s，68 s，在白色區(qū)域停留的時(shí)間都不超過(guò)90s，同時(shí)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也顯示出該突變體與野生型有顯著性差異（P＜0．01，圖4），低于設(shè)定的篩選突變體標(biāo)準(zhǔn)，表明其長(zhǎng)時(shí)記憶的能力是有缺陷的。

Fig．4 Behavior test of candidate mutant（ENUF1）and wild-type ENU：N-ethyl-N-nitrosourea**P＜0．01 vs wild-type

隨后，我們將該候選突變體與野生型AB進(jìn)行交配，對(duì)其3月齡F2代（n＝30）進(jìn)行了同樣的抑制逃避的行為學(xué)測(cè)試，每條魚(yú)進(jìn)行了5次測(cè)試，展示了F2代行為學(xué)測(cè)試的結(jié)果（圖5）。在候選突變體的30條F2代中，在突變體篩選標(biāo)準(zhǔn)（在白色區(qū)域停留時(shí)間小于90 s）以下的數(shù)量為13個(gè)，大約為50%，所以該突變體可能為一個(gè)顯性突變體。同時(shí)，對(duì)兩類不同表現(xiàn)的候選突變體F2代的行為學(xué)結(jié)果進(jìn)行了分析，在白色區(qū)域停留時(shí)間小于90 s的所有突變體F2代魚(yú)（13條）的平均時(shí)間為70 s，而停留時(shí)間大于90 s的所有F2代魚(yú)（17條）的平均時(shí)間為163 s，兩者之間具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01，圖6）。

Fig．5 Behavior test of candidate mutant（ENU F2）ENU：N-ethyl-N-nitrosourea

Fig．6 Statistic data of behavior test in wild-type and two different candidate mutant types ENU F2；ENU：N-ethyl-N-nitrosourea ENUF2＜90：ENU F2 spent time in white compartments is less than 90s during 3min inhibitory avoidance task；ENU F2＞90：ENU F2 spent time is more than 90 s**P＜0．01 vs ENU F2＜90

2．4 基因表達(dá)水平鑒定突變體

在學(xué)習(xí)記憶發(fā)生的同時(shí)，伴隨著基因表達(dá)的變化。為了進(jìn)一步確定突變體，我們對(duì)候選突變體的F2代進(jìn)行基因表達(dá)的檢測(cè)。c-fos是早期即刻基因中編碼調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的重要基因，我們選擇c-fos基因的表達(dá)對(duì)獲得的候選突變體進(jìn)行鑒定。首先我們研究了野生型成年斑馬魚(yú)在對(duì)新環(huán)境的探索過(guò)程中c-fos隨時(shí)間變化的表達(dá)變化，作為基因表達(dá)的基線，然后選取在正常狀態(tài)下表達(dá)差異最大的時(shí)間點(diǎn)，來(lái)研究不同個(gè)體之間的差異。

為了使c-fos的表達(dá)明顯增加，我們先將成年斑馬魚(yú)從喂養(yǎng)的容器取出放入新的環(huán)境中（一個(gè)平均分為黑白兩個(gè)區(qū)域的塑料水槽）自由探索3 min，激活學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)基因表達(dá)后放回最初的容器中，等候不同的時(shí)間后，快速處死，分離斑馬魚(yú)端腦并提取RNA，利用qRT-PCR研究c-fos在不同恢復(fù)期的表達(dá)情況。24條魚(yú)被分成了6組（n＝4）：對(duì)照組，不經(jīng)過(guò)新環(huán)境的探索直接處死；0 min，5 min，15 min，30 min，3 h：指放回最初的白色容器內(nèi)0 min，5 min，15 min，30 min，3 h后快速處死。新環(huán)境的探索使cfos的表達(dá)隨著時(shí)間變化呈現(xiàn)拋物線狀，在處理后5 min時(shí)表達(dá)量增高，在處理后15 min時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，處理后3 h時(shí)降低到未探索前的水平，表明這種處理對(duì)c-fos基因的表達(dá)改變是有效的（圖7）。處理后15 min時(shí)c-fos的表達(dá)水平最高，約為是對(duì)照的6倍，因此我們選取了處理后15 min這個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)突變體的c-fos表達(dá)進(jìn)行研究。

Fig．7 Time lapse expression of c-fos after behavioral treatment in zebrafish0 min，5 min，15 min，30 min and 3 h：Fishes were sacrificed 0 min，5 min，15 min，30 min and 3 h after behavioral treatment

我們對(duì)候選突變體F2代個(gè)體進(jìn)行了基因表達(dá)水平的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在對(duì)候選突變體F2代個(gè)體（n＝30）進(jìn)行了相同的行為學(xué)探索處理之后，研究處理后15 min的基因表達(dá)情況。我們認(rèn)為候選突變體F2代個(gè)體c-fos基因表達(dá)變化為野生型表達(dá)變化的2倍以上為異常，可以排除個(gè)體差異性，考慮是突變體。結(jié)果顯示，c-fos基因表達(dá)是野生型對(duì)照組表達(dá)變化的2倍以上的候選突變體F2代個(gè)體數(shù)為13個(gè)（圖8），即30條魚(yú)中有13條魚(yú)的基因表達(dá)是異常，數(shù)量約為50%，與行為學(xué)結(jié)果一致，從基因水平進(jìn)一步上驗(yàn)證了該突變體為顯性突變。同時(shí)還對(duì)兩類不同表達(dá)差異的F2代個(gè)體c-fos基因表達(dá)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示c-fos基因表達(dá)變化為野生型對(duì)照組的倍數(shù)改變?cè)?倍以下的候選突變體F2代個(gè)體的平均相對(duì)倍數(shù)為1．56，倍數(shù)改變?cè)?倍以上的所有F2代個(gè)體的平均相對(duì)倍數(shù)為2．78（圖9），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。

Fig．8 Expression of c-fos gene in candidate mutant（ENU F2）after behavioral treatmentENU：N-ethyl-N-nitrosourea

Fig．9 Statistic data of c-fos gene expression in two different candidate mutant types ENU F2 Blow 2：ENU F2 c-fos gene expression relative fold change is twice as low to wild-type control；Above 2：ENU F2 is twice fold as high to control；ENU：N-ethyl-N-nitrosourea**P＜0．01 vs blow 2

3 討論

這里我們使用一種簡(jiǎn)單快捷的行為學(xué)方法篩選得到了一例斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶的突變體fgt，這種突變體的長(zhǎng)時(shí)記憶能力明顯低于正常野生型，但表現(xiàn)出正常的運(yùn)動(dòng)活性和正常的黑色傾向性。

在突變體篩選中，我們使用抑制逃避行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，由于斑馬魚(yú)有明顯的黑色傾向性，所以我們使用電擊的方法抑制其進(jìn)入黑色區(qū)域而停留在白色區(qū)域。24 h后，不再電擊，測(cè)試其停留在白色區(qū)域的時(shí)間。斑馬魚(yú)停留在白色區(qū)域的時(shí)間越長(zhǎng)，表明其長(zhǎng)時(shí)記憶越好，而依然保持黑色傾向性的魚(yú)則有可能是長(zhǎng)時(shí)記憶有缺陷。抑制逃避實(shí)驗(yàn)，裝備簡(jiǎn)單，僅僅使用一個(gè)帶隔板的塑料水槽以及一個(gè)電極和刺激器就可以完成；花費(fèi)的時(shí)間少，第一天2次訓(xùn)練約4 min，第二天的測(cè)試時(shí)間也只需4 min。本文中斑馬魚(yú)對(duì)黑暗的傾向性和斑馬魚(yú)的長(zhǎng)時(shí)記憶效果都與Blank等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致［8］，同時(shí)由于改善刺激時(shí)間和頻率，加大了學(xué)習(xí)強(qiáng)度和時(shí)間，我們的長(zhǎng)時(shí)記憶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更加穩(wěn)定，誤差更小。

突變體fgt在訓(xùn)練后的測(cè)試中，停留在白色區(qū)域的時(shí)間明顯大于野生型停留在白色區(qū)域的時(shí)間，且在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)1代突變體fgt的長(zhǎng)時(shí)記憶均表現(xiàn)出明顯異常。而對(duì)其30條F2代個(gè)體進(jìn)行同樣實(shí)驗(yàn)，有近一半的F2代個(gè)體（13／30）在長(zhǎng)時(shí)記憶上有缺陷，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。

研究發(fā)現(xiàn)早期即刻基因（immediate-early genes，IEGs）參與長(zhǎng)時(shí)記憶，在強(qiáng)烈的突觸和神經(jīng)遞質(zhì)等的刺激下最早開(kāi)始表達(dá)，通過(guò)合成調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子或者信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等來(lái)改變神經(jīng)元的活動(dòng)和功能，從而引起突觸重塑。突觸重塑不僅參與細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分化過(guò)程，而且在細(xì)胞信息傳遞和能量代謝中起著重要作用，是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)［2］。

利用陰性雜交技術(shù)，Lanahan and Worley已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30～40種早期即刻基因，其中約有10～15種編碼調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，編碼調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)增強(qiáng)特異性上游基因的表達(dá)來(lái)直接影響細(xì)胞生理功能，例如c-fos、c-jun和zif268；其余一部分編碼多種生物學(xué)“效應(yīng)器”蛋白，如Arc、Homer 1a，與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子相比其影響更加明確直接［3］。

c-fos基因是與學(xué)習(xí)記憶有著密切聯(lián)系的早期即刻基因，它編碼調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的激活神經(jīng)元中功能性的標(biāo)記基因［9］。斑馬魚(yú)中cfos基因的表達(dá)與大鼠中的表達(dá)時(shí)間和效果類似。斑馬魚(yú)在一個(gè)新的環(huán)境中進(jìn)行探索后會(huì)刺激c-fos基因表達(dá)隨著時(shí)間變化呈現(xiàn)拋物線狀改變，在處理后5min時(shí)表達(dá)量有所增高，在處理后15 min時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，處理后3 h時(shí)幾乎恢復(fù)到?jīng)]有探索過(guò)之前的水平，表明這樣的行為學(xué)處理得到了預(yù)期的結(jié)果，這與大鼠早期即刻基因表達(dá)的報(bào)道一致。John F．Guzowski等發(fā)現(xiàn)在大鼠經(jīng)過(guò)處理后c-fos的RNA水平在 0．5 h時(shí)達(dá)到最高，2 h降到正常水平［3］。我們選取處理后15 min c-fos基因表達(dá)最高的時(shí)刻作為基因水平篩選的時(shí)間點(diǎn)。qRT-PCR結(jié)果顯示候選突變體的F2代中有近一半（13／30）的斑馬魚(yú)c-fos基因表達(dá)的改變顯著高于野生型對(duì)照組的基礎(chǔ)水平2倍以上，而另一半（17／30）這個(gè)結(jié)果則與基礎(chǔ)水平相差不大。這個(gè)比例與行為學(xué)中長(zhǎng)時(shí)記憶缺陷的個(gè)體比例是基本一致的，因此確定篩選獲得的突變體是顯性突變。

綜上，我們采用行為學(xué)篩選和基因水平鑒定的方法，獲得了一例斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)的突變體fgt。該長(zhǎng)時(shí)記憶缺陷的突變體的獲得對(duì)于進(jìn)一步研究學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的分子和神經(jīng)學(xué)機(jī)制，相關(guān)基因的信號(hào)傳導(dǎo)通路等具有重要的作用。

［1］ Kandel E R．The molecular biology of memory storage：a dialogue between genes and synapses［J］．Sci，2001，294（5544）：1030-1038．

［2］ Bramham CR，Worley PF，Moore M J，et al．The immediate early gene arc／arg3．1：regulation，mechanisms，and function［J］．J Neurosci，2008，28（46）：11760-11767．

［3］ Guzowski J F，Setlow B，Wagner E K，et al．Experiencedependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning：a comparison of the immediate-early genes Arc，cfos，and zif268［J］．J Neurosci，2001，21（14）：5089-5098．

［4］ Mayford M，Kandel ER．Genetic approaches to memory storage［J］．Trends Genet，1999，15（11）：463-470．

［5］ Haffter P，Granato M，Brand M，et al．The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish，Danio rerio［J］．Development，1996，123：1-36．

［6］ Salas C，Broglio C，Duran E，et al．Neuropsychology of learning and memory in teleost fish［J］．Zebrafish，2006，3（2）：157-171．

［7］ Solnica-Krezel L，Schier A F，Driever W．Efficient recovery of ENU-induced mutations from the zebrafish germline［J］．Genetics，1994，136（4）：1401-1420．

［8］ Blank M，Guerim L D，Cordeiro R F，et al．A one-trial inhibitory avoidance task to zebrafish：rapid acquisition of an NMDA-dependent long-term memory［J］．Neurobiol Learn Mem，2009，92（4）：529-534．

［9］ Kovács K J．Measurement of immediate-early gene activationc-fos and beyond［J］．J Neuroendocrinol，2008，20（6）：665-672．