HO／CO在甲醛炎性痛大鼠脊髓痛傳導(dǎo)及痛覺過敏產(chǎn)生中的作用*

李慧娜，郭莉華，李清君，劉 蕾

血紅素氧合酶 （heme oxygenase，HO）是生成內(nèi)源性一氧化碳（carbon monoxide，CO）最主要的限速酶，可催化亞鐵血紅素（heme）產(chǎn)生CO。HO-1為HO的一個亞型，可被多種因素所誘導(dǎo)表達。我室的研究已證實，甲醛炎性痛可誘導(dǎo)脊髓HO-1表達增多［1］，但HO／CO在甲醛炎性痛大鼠脊髓痛覺過敏形成中發(fā)揮什么作用并不清楚。

已有一些HO／CO在疼痛模型中發(fā)揮促痛作用的相關(guān)報道。Li等［2］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠單側(cè)后爪切開或結(jié)扎L5或L6脊神經(jīng)根后，出現(xiàn)同側(cè)后爪異常性疼痛和熱痛覺過敏，給大鼠應(yīng)用HO的抑制劑鋅原卟啉（zinc protoporphyrin，Znpp）后能夠劑量依賴性的減輕疼痛程度，但對痛覺過敏的影響不明顯。另有研究發(fā)現(xiàn)，HO的抑制劑可以降低由鞘內(nèi)注射N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑 （a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionate，AMPA）及神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸所誘導(dǎo)的疼痛相關(guān)行為［3］，這些研究均證實，HO／CO系統(tǒng)在不同的疼痛模型中均發(fā)揮促痛作用。但迄今為止，有關(guān)HO／CO在脊髓熱痛覺過敏和機械性痛覺過敏產(chǎn)生中的作用尚無定論。

因此，本實驗通過甲醛炎性痛大鼠鞘內(nèi)注射HO的抑制劑Znpp，觀察其對甲醛炎性痛大鼠的自發(fā)痛反應(yīng)以及對熱和機械性痛閾的影響，通過正常大鼠鞘內(nèi)注射 HO的激動劑氯化高鐵血紅素（hemin），觀察其對正常大鼠熱和機械痛閾的影響，探討 HO／CO在脊髓痛覺傳導(dǎo)以及熱和機械性痛覺過敏形成中的作用。

1 材料與方法

1．1 實驗動物和分組

實驗選用健康雄性SD大鼠50只，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重（250±20）g。將動物隨機分為2大組。

第1組又分為6個亞組（n＝5），分別為正常對照組（control組）、甲醛組（F 24 h組）、甲醛 ＋溶劑DMSO組（DMSO組）、甲醛 ＋Znpp 50μg組（Znpp 50 μg組）、甲醛＋Znpp 100μg組（Znpp 100μg組）和甲醛＋Znpp 300μg組（Znpp 300μg組）。DMSO組和各劑量Znpp組預(yù)先鞘內(nèi)注射相應(yīng)的溶劑DMSO或Znpp溶液（半量），30 min后足底注射甲醛并進行痛反應(yīng)評分，注射甲醛后24 h再次鞘內(nèi)注射溶劑DSMO或Znpp溶液（半量），30 min后測定熱輻射縮足反射潛伏期和機械刺激縮足反射閾值。

第2組又分為4個亞組（n＝5），分別為正常對照組（control組）、Hemin溶劑 NaOH組、Hemin 187．5 μg組和Hemin 375μg組。溶劑NaOH組和Hemin各劑量組于正常大鼠鞘內(nèi)注射相應(yīng)的溶劑或激動劑后30 min測定熱輻射縮足反射潛伏期和機械刺激縮足反射閾值。

1．2 主要儀器及試劑

Von Frey刺激纖維和BME-410C型全自動熱痛刺激儀均為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所產(chǎn)品；Znpp和Hemin均為美國 Sigma公司產(chǎn)品；Znpp溶劑二甲基亞楓（DMSO）為德國 Serva公司產(chǎn)品，Hemin溶劑氫氧化鈉（NaOH）為天津市東方化工廠產(chǎn)品，甲醛溶液為石家莊有機化工廠產(chǎn)品。

1．3 鞘內(nèi)注射方法

參照Mestre等［4］所建立的方法進行。大鼠吸入乙醚麻醉，用26．5-G連有聚乙烯管的針頭經(jīng)腰5（L5）和腰 6（L6）椎間隙行椎管穿刺。以穿刺針內(nèi)有腦脊液流出或動物出現(xiàn)突然的側(cè)向甩尾運動，作為穿刺成功的標(biāo)志。鞘內(nèi)注射采用微量進樣器進行，將微量進樣器針頭插入導(dǎo)管內(nèi)，緩慢推注藥物，推注過程約1 min。在此過程中未觀察到動物出現(xiàn)痛苦或疼痛的跡象。

1．4 甲醛炎性痛模型的建立及痛反應(yīng)評分方法

給大鼠右后足底中心皮下注射5%甲醛溶液0．2 ml復(fù)制疼痛模型。甲醛溶液注射后，立即將動物放入一樹脂玻璃箱中進行痛反應(yīng)評分，觀察時間為1 h。痛反應(yīng)評分采用 Dubbisson與 Dennis［5］建立的加權(quán)積分法（weighted scores），評分分為4級：3分：舔、咬和劇烈抖動注射足；2分：注射足高抬，走動時不著臺面，完全不能持重；1分：注射足不完全著地，不持重或輕微持重或行走時出現(xiàn)跛行；0分：自由行走，跛行不明顯。0分表示無明顯疼痛反應(yīng)，痛反應(yīng)評分越高，表明疼痛越劇烈。對以上各級每5 min的評分做加權(quán)平均，作為甲醛炎性痛的痛反應(yīng)評分。痛反應(yīng)評分加權(quán)平均 ＝∑pt／300，其中p為大鼠傷害性痛行為反應(yīng)的評分，t為該行為反應(yīng)的持續(xù)時間（s）。

1．5 熱輻射縮足反射潛伏期測定

將動物置于15 cm×15 cm×20 cm有機玻璃罩內(nèi)，底為厚約2 mm的玻璃板，將熱刺激儀的光源照射在大鼠足底部位，并調(diào)節(jié)照射光的直徑至 5 mm大小，電壓設(shè)置為 10 V，記錄從開始照射到大鼠抬足所需時間作為熱輻射縮足反射潛伏期，潛伏期顯著縮短被認為有熱痛覺過敏發(fā)生。大鼠足底同一點照射5次，每次照射之間間隔10 min，取平均值作為熱輻射縮足潛伏期。兩側(cè)足底照射之間間隔5 min。如果照射時間大于30 s大鼠仍無反應(yīng)則停止照射，以免造成足底組織過度熱損傷。

1．6 機械刺激縮足反射閾值測定

將動物置于與上述相同的有機玻璃罩內(nèi)，底為用金屬絲制成的網(wǎng)格墊，使用不同粗細的 von Frey纖維（刺激強度分別為 0．09 g，0．18 g，0．28 g，0．52 g，1．12 g，3．8 g，5．5 g，7．7 g，10．4 g，18．2 g，44 g和61 g），通過金屬網(wǎng)格刺激大鼠足底，每個強度反復(fù)刺激10次，每次刺激之間間隔 3～5 s，出現(xiàn)縮足反射5次以上的刺激強度即為大鼠對機械刺激的反應(yīng)閾值。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用 t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 鞘內(nèi)注射 Znpp對甲醛炎性痛大鼠自發(fā)痛反應(yīng)的影響

注射甲醛后，動物即出現(xiàn)舔、咬、搖動注射側(cè)腳掌等疼痛相關(guān)表現(xiàn)。30 min后注射部位出現(xiàn)紅、腫等組織炎癥表現(xiàn)。甲醛炎性痛大鼠鞘內(nèi)注射溶劑DMSO后，甲醛誘導(dǎo)的大鼠自發(fā)疼痛反應(yīng)評分無明顯改變。與甲醛組相比，預(yù)先鞘內(nèi)注射 HO抑制劑Znpp 50μg、100μg或 300μg，均可明顯抑制甲醛誘導(dǎo)的傷害性反應(yīng)，表現(xiàn)為大鼠疼痛反應(yīng)評分明顯降低，且隨Znpp劑量的增大，其對大鼠痛行為的抑制作用也越明顯（圖1）。

Fig．1 Effect of Znpp on the spontaneous pain in one hour following subcutaneous formalin injection into the plantar surface of the right hindpaw．The weighted pain score of Dubuisson and Dennis was used for the pain rating DMSO：Formalin＋DMSO group Znpp 50μg：Formalin＋Znpp 50μg group；Znpp 100μg：Formalin＋Znpp 100μg group Znpp 300μg：Formalin＋Znpp 300μg group；DMSO：Dimethyl sulfoxide；Znpp：Zinc protoporphyrim*P＜0．05，**P＜0．01 vs formalin group

2．2 鞘內(nèi)注射Znpp和Hemin對甲醛炎性痛大鼠及正常大鼠熱輻射縮足潛伏期的影響

實驗中觀察到，與control組比較，足底注射甲醛24 h后，注射足熱輻射縮足潛伏期明顯延長，非注射足熱輻射縮足潛伏期明顯縮短，說明注射足出現(xiàn)了熱痛覺麻痹，而非注射足出現(xiàn)了熱痛覺過敏。與單純甲醛組比較，甲醛＋DSMO組或甲醛＋Znpp各劑量組動物注射足熱輻射縮足潛伏期均無明顯改變；而在非注射足，甲醛＋DSMO組熱輻射縮足潛伏期與甲醛組比較無明顯改變，甲醛＋Znpp各劑量組動物熱輻射縮足潛伏期均明顯高于甲醛組，并且Znpp的劑量越大，熱輻射縮足潛伏期增加越明顯（圖2）。

Fig．2 Changes of thermal withdrawal latency after intrathecal injection of Znpp in rats with formalin immflammtory pain**P＜0．01 vs control；＃＃P＜0．01 vs F 24 h group DMSD：Dimethyl sulfoxide；Znpp：Zinc protoprphyrin

與正常對照組大鼠相比，Hemin溶劑NaOH組動物雙足熱輻射縮足潛伏期均無明顯改變。不同劑量激動劑Hemin組動物，雙足熱輻射縮足潛伏期均明顯縮短，雙足之間無明顯差異，不同劑量組之間也無明顯差別（圖3）。

Fig．3 Changes of thermal withdrawal latency after intrathecal injection of different dose Hemin to normal rat．There is no obviously difference between Hemin 187．5μg group and Hemin 375μg group in thermal withdrawal latency*P＜0．05 vs control group

2．3 鞘內(nèi)注射Znpp和Hemin對甲醛炎性痛大鼠及正常大鼠機械刺激縮足反射閾值的影響

實驗中觀察到，與control組比較，足底注射甲醛24 h后，注射足機械刺激縮足反射閾值明顯延長，非注射足機械刺激縮足反射閾值明顯縮短，說明注射足出現(xiàn)了機械性痛覺麻痹，而非注射足出現(xiàn)了機械性痛覺過敏。與單純甲醛組相比，甲醛＋Znpp各劑量組以及甲醛＋DSMO組大鼠注射足機械刺激縮足反射閾值均無明顯改變；而在非注射足，甲醛＋DSMO組與單純甲醛組比較，機械刺激縮足反射閾值無明顯改變，而甲醛＋Znpp各劑量組大鼠機械刺激縮足反射閾值則明顯升高，且Znpp的劑量越大，機械刺激縮足反射閾值增高越明顯（圖4）。

Fig．4 Changes of mechanical withdrawal threshold after intrathecal injection of Znpp in rats with formalin immflammtory pain DMSO：Dimethyl sulfoxide；Znpp：Zinc protoporphyrin**P＜0．01 vs control；＃＃P＜0．01 vs F24 h group

本實驗還觀察到，正常大鼠鞘內(nèi)注射Hemin溶劑NaOH后，與正常對照組相比，雙足機械刺激縮足反射閾值均無明顯改變。正常大鼠鞘內(nèi)注射HO激動劑Hemin溶液后，雙足機械刺激縮足反射閾值均明顯降低，雙足之間無明顯差異，不同劑量組之間也無明顯差異（圖5）。

Fig．5 Changes of mechanical withdrawal threshold following intrathecal injection of different dose Hemin to normal rat．There is no obviously difference between Hemin 187．5μg group and Hemin 375μg group in mechanical withdrawal threshold**P＜0．01 vs control group

3 討論

我們在以往的實驗中觀察到，甲醛炎性痛可誘導(dǎo)大鼠脊髓后角HO-1表達增多，且以甲醛注射后24 h時表達增高最為顯著［1］，但 HO-1表達增多及CO產(chǎn)生增多在脊髓的痛覺傳遞和痛覺過敏中發(fā)揮什么作用，目前尚不清楚。

我室以往的研究發(fā)現(xiàn)，足底注射甲醛24 h時，大鼠的熱輻射縮足潛伏期及機械刺激縮足反射閾值變化最為顯著，表明此時大鼠的熱和機械性痛覺過敏最為明顯。因此，本實驗選擇甲醛注射后24 h作為時間點，觀察鞘內(nèi)注射HO抑制劑Znpp對甲醛炎性痛大鼠熱輻射縮足潛伏期和機械刺激縮足反射閾值的影響，同時觀察了鞘內(nèi)注射HO激動劑Hemin對正常大鼠熱輻射縮足潛伏期和機械刺激縮足反射閾值的影響，以探討HO／CO在脊髓痛覺傳遞以及熱和機械痛覺過敏產(chǎn)生中的作用。

結(jié)果顯示，預(yù)先鞘內(nèi)注射不同劑量Znpp，可明顯降低注射甲醛所引起的大鼠自發(fā)痛反應(yīng)程度，提示HO／CO參與了脊髓痛感覺傳遞過程，并在此過程中發(fā)揮促痛作用。

預(yù)先鞘內(nèi)注射不同劑量Znpp，可使甲醛炎性痛大鼠的非注射足熱輻射縮足潛伏期明顯延長，機械刺激縮足反射閾值也明顯升高，且Znpp劑量越大，這種作用越明顯。表明Znpp在抑制脊髓HO活性及其誘導(dǎo)的CO產(chǎn)生的同時，減輕了甲醛炎性痛大鼠熱和機械性痛覺過敏程度，提示HO／CO參與并促進了甲醛炎性痛大鼠熱和機械性痛覺過敏的產(chǎn)生。

正常大鼠鞘內(nèi)注射HO的激動劑Hemin后，雙側(cè)足熱輻射縮足潛伏期明顯縮短，機械刺激縮足反射閾值也明顯降低，表明鞘內(nèi)注射HO的激動劑Hemin可誘導(dǎo)正常大鼠產(chǎn)生熱和機械性痛覺過敏，這一結(jié)果進一步證實，HO／CO系統(tǒng)的激活在脊髓敏感化和脊髓的痛覺過敏產(chǎn)生機制中發(fā)揮重要作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，足底注射甲醛溶液后，注射足出現(xiàn)了感覺減退或感覺麻痹現(xiàn)象，可能是由于甲醛作為化學(xué)性刺激物，引起外周組織及其神經(jīng)末梢傷害性感受器損傷所致。

有關(guān)HO／CO系統(tǒng)的激活在脊髓敏感化和脊髓的痛覺過敏產(chǎn)生中的作用機制尚不十分清楚，根據(jù)現(xiàn)有的研究資料分析，可能是多種途徑共同參與的結(jié)果。

有研究證實［6］，CO釋放分子（CORM-2）通過激活HO-1和蛋白激酶 B（Akt）誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）的高表達，而磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）的抑制劑使CORM-2誘導(dǎo)的HIF-1α表達顯著減少，提示HO／CO可通過 PI3K／Akt途徑發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。而有研究者發(fā)現(xiàn)，PI3K／Akt途徑是傷害性疼痛產(chǎn)生的重要參與者。Pereira等［7］通過腳爪注射胰島素制備大鼠炎癥和疼痛模型，發(fā)現(xiàn)預(yù)先鞘內(nèi)注射或腦室內(nèi)注射PI3k抑制劑，可劑量依賴性減輕胰島素誘導(dǎo)的大鼠腳爪疼痛程度。因此，我們推測HO／CO可能通過激活PI3K／Akt而發(fā)揮其促進中樞敏感化的作用。

HO誘導(dǎo)的內(nèi)源性CO以旁分泌或自分泌的方式作用于鄰近細胞，與可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）結(jié)合，并激活該酶，活化的sGC使cGMP水平迅速升高，而cGMP則以細胞內(nèi)第二信使的身份發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)［8］在小鼠福爾馬林炎性痛模型中，鞘內(nèi)注射cGMP可增加小鼠舔足次數(shù)并促進其機械痛覺過敏，提示cGMP在脊髓痛覺過敏產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。因此，我們推測HO／CO也可能通過sGC-cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致了中樞敏感化的形成。

越來越多的資料顯示，在多種病理過程中，HO／CO系統(tǒng)和NOS／NO系統(tǒng)之間存在著密切聯(lián)系。已有一些研究證實，HO／CO系統(tǒng)對NOS／NO系統(tǒng)的激活具有促進作用［9］。有大量研究結(jié)果證明，NOS／NO在脊髓痛覺敏化過程中發(fā)揮重要作用。Roh等［10］發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射σ-1受體激動劑可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生機械性痛覺過敏和熱痛覺過敏，但預(yù)先鞘內(nèi)注射nNOS抑制劑，則可抑制該機械性痛覺過敏和熱痛覺過敏的產(chǎn)生，提示NOS／NO系統(tǒng)在脊髓具有促進痛覺過敏形成的作用。因此推測，炎性痛時脊髓HO／CO激活也可能通過NOS／NO參與痛覺過敏的形成過程。

綜上所述，鞘內(nèi)給予HO的抑制劑Znpp可以抑制足底注射甲醛誘導(dǎo)的自發(fā)痛反應(yīng)及其痛覺過敏，正常大鼠鞘內(nèi)給予HO的激動劑Hemin則可誘導(dǎo)其產(chǎn)生痛覺過敏。表明HO／CO系統(tǒng)在脊髓傷害性信息的傳導(dǎo)和痛覺過敏的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。

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