張國霞,周愛玲,張貴萍,胡亞娥,茅家慧
(南通大學醫(yī)學院病理生理學系,江蘇南通226001)
近幾年的臨床研究和動物實驗證據(jù)說明了腦內(nèi)神經(jīng)炎癥與多種急慢性神經(jīng)退行性疾病如帕金森?。≒arkinson’s disease,PD)、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD)和多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)等的發(fā)生和發(fā)展有密切聯(lián)系[1,2]。
神經(jīng)炎癥反應的一個很重要特征是腦內(nèi)固有免疫細胞尤其是小膠質(zhì)細胞的激活。持續(xù)的小膠質(zhì)細胞激活會通過釋放過量神經(jīng)毒性的炎癥因子如一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)、腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor,TNF)、白介素 6(interleukin-6,IL-6)及白介素 1β(in-terleukin-1β,IL-1β)引起神經(jīng)損傷[3,4]。
Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)作為脂多糖 (lipopolysaccharides,LPS)受體在先天免疫中所起的作用最重要。有研究表明AD腦中TLR4表達增多。那么,海馬這一與AD密切相關(guān)的組織中——海馬神經(jīng)元能否發(fā)生炎癥反應呢?我們的實驗首先研究海馬神經(jīng)元是否有TLR4介導的MyD88依賴途徑。在一般炎癥細胞中[5,6],TLR4活化后與MyD88結(jié)合,依次激活下游信號分子IL-1受體相關(guān)激酶(IL-1 receptor associated kinase,IRAK)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF-αreceptor associated factor 6,TRAF6);然后,TRAF6激活 NF-κB信號通路[7]:NF-κB一般是由p65和p50亞單位組成的異源二聚體。在未激活狀態(tài)下,NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合以無活性的形式存在于胞漿。LPS激活TLR4后解除IκB對 NF-κB的抑制作用、促進 NF-κB核易位、激發(fā)炎癥相關(guān)基因的表達,促進IL-1、TNF-α等合成和釋放。
本研究采用原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元作為研究對象,用TLR4配體LPS或TLR4抗體預處理海馬神經(jīng)元,以激活或阻斷TLR4的作用,運用RT-qPCR、免疫熒光及Western blot等技術(shù),探討海馬神經(jīng)元是否有TLR4介導的的MyD88依賴途徑及該途徑的激活或阻斷后對炎癥介質(zhì)生成的影響。通過研究,期望在理論上為海馬神經(jīng)元TLR4介導的MyD88依賴途徑在神經(jīng)炎癥方面的作用提供實驗依據(jù)。
1.1.1 動物 出生1 d內(nèi) SPF級 SD大鼠,由南通大學實驗動物中心提供。
1.1.2 試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基和 B27添加劑(Invitrogen),胎牛血清(杭州四季青),多聚賴氨酸、脂多糖、阿糖胞苷、胰蛋白酶(Sigma)。Trizol(Invitrogen)、SYBR Green Master(Rox)(Roche),TLR4 antibody、β-actin antibodies(SANTA CRUZ),MyD88 antibody(CST),TRAF6 antibody(Epitomics),ECL(Millipore),ELISA試劑盒(R&B)。
無菌操作下取新生1 d內(nèi)SD乳鼠海馬回,放入冰D-Hank’s,在解剖顯微鏡下剔除腦膜和血管,剪碎組織成約1 mm3,37℃下0.125%胰蛋白酶消化20 min并以巴斯德管吹打數(shù)次,用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化,經(jīng)孔徑為75μm的尼龍網(wǎng)過濾,離心,棄上清,用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基吹散細胞,細胞計數(shù)板計數(shù),以1×106cells/well種植于多聚賴氨酸包被的六孔板中,置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃,5%CO2),24 h后全量換液,72 h后加阿糖胞苷,以后每3天換液一次。培養(yǎng)7 d后采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和Hoechst的細胞免疫熒光雙標方法,對培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元進行純度的鑒定。
將 LPS按儲存濃度(1 mg/ml)溶于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,避光存于-20℃,用時基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至終濃度10μg/ml,以不同時間點作用于海馬神經(jīng)元。
將海馬神經(jīng)元以10 000 cells/well每孔的密度種植于放置圓玻片的24孔板內(nèi),培養(yǎng)7 d后加入TLR4抗體培養(yǎng),2 h后加入脂多糖處理。將圓玻片放入PBS中清洗,然后放入4%多聚甲醛室溫下固定30 min,PBS清洗三次,每次五分鐘,室溫下10%山羊血清封閉1 h,甩干后加入兔抗大鼠一抗(NF-κB antibody),37℃,60 min,后 4℃過夜。PBS清洗 3遍后加入羊抗兔熒光二抗室溫下避光孵育1 h,甩干后加1%Hochest染核15 min,用超純水沖洗,加防熒光淬滅劑,倒置顯微鏡下觀察,拍片。
提取各組細胞中的RNA,并進行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照以下參數(shù)進行PCR擴增反應,預變性95℃10 min,變性 95℃ 15 s,退火 60℃ 30 s,延伸 72℃ 30 s,40次循環(huán)后再延伸 72℃ 5 min,β-actin作為內(nèi)參。所用引物序列如下:MyD88基因擴增序列上游引物5′GTGGTGGTTGTTTCTGACGAT 3′,下 游 引 物 5′CGCAGATAGTGATGAACCGTAG3′TRAF6上游引物5′CATTGTGAATTCGCTCTAGTGA3′, 下 游 引 物 5′GGACAGCTTTGATCGTGGA3′,β-actin上 游 引 物 5′CAGGTCATCACTATCGGCAAT 3′,下游引物 5′AGGTCTTTACGGATGTCAACG 3′。
將六孔板中處理好的各組細胞棄培養(yǎng)基,用PBS輕洗,加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF,使PMSF的終濃度為1 mmol/L。充分裂解后,將混合液在4℃14 000 r/min離心15 min,取上清測總蛋白濃度。調(diào)整各組總蛋白濃度相等(20μg),用10%PAGE膠電泳分離,再轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h,后加一抗4℃過夜。TBST洗三次,加二抗室溫1 h,加ECL顯影。
將培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元分正常對照組、LPS刺激組、TLR4抗體阻斷加LPS刺激組,收集細胞培養(yǎng)上清,按ELISA試劑盒說明進行實驗,在酶標儀450μm處讀取A值,繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線計算培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和 NO蛋白含量。。
所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示,用軟件 SPSS17.0進行統(tǒng)計分析。
2.1.1 RT-qPCR 結(jié)果顯示,正常對照組海馬神經(jīng)元中MyD88和TRAF6 mRNA表達相對較少,LPS刺激4~12 h時,MyD88和TRAF6 mRNA的表達增加,與正常對照組比較,有非常顯著的差異(P<0.01),但到24 h時與正常對照組無顯著性差異(P>0.05,圖 1)。
Fig.1 Effect of LPSon MyD88 and TRAF6 mRNA of hippocampal nuerons**P<0.01 vs normal group
2.1.2 Western Blot結(jié)果可見,在正常對照組海馬神經(jīng)元中,MyD88和TRAF6蛋白表達相對較少,LPS刺激后,其蛋白水平表達增加。與正常對照組相比,在LPS刺激不同時間點后,MyD88和TRAF6蛋白表達明顯上調(diào),有顯著或非常顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05,P<0.01,圖 2)。
Fig.2 Effects of LPSon MyD88 and TRAF6 protein of hippocampal nuerons MyD88:Myeloid differentiation facfor 88;TRAF6:TNF-αreceptor assoiated factor 6*P<0.05,**P<0.01 vs normal group
2.2.1 RT-qPCR 結(jié)果顯示,正常對照組海馬神經(jīng)元中MyD88和TRAF6 mRNA表達相對較少;LPS單一刺激組:經(jīng) LPS刺激后,海馬神經(jīng)元 MyD88和TRAF6 mRNA明顯高于正常對照組(P<0.01);TLR4抗體阻斷聯(lián)合LPS剌激組:給以TLR4抗體預處理后,再給以與 LPS單一刺激組相同濃度的 LPS刺激海馬神經(jīng)元后,其MyD88和TRAF6 mRNA的表達明顯低于 LPS單一刺激組(P<0.05,圖3)。
Fig.3 Effect of anti-TLR4 on MyD88 and TRAF6 mRNA in LPS-activated hippocampal nuerons MyD88:Myeloid differentiation facfor 88;TRAF6:TNF-αreceptor assoiated factor 6;LPS:Lipopolysaccharides;TLR4:Toll-like receptor 4**P<0.01 vs normal group;#P<0.05 vs LPSgroup
2.2.2 Western blot結(jié)果可見,正常對照組海馬神經(jīng)元中MyD88和TRAF6蛋白表達相對較少;LPS刺激后的海馬神經(jīng)元,MyD88和TRAF6蛋白表達明顯高于正常對照組(P<0.01);TLR4抗體阻斷聯(lián)合LPS剌激組:給以TLR4抗體預處理后,再給以與LPS單一刺激組相同濃度的 LPS刺激海馬神經(jīng)元后,其MyD88和TRAF6蛋白的表達明顯低于LPS單一刺激組 (P<0.05,P<0.01,圖 4)。
Fig.4 Effects of anti-TLR4 on MyD88 and TRAF6 protein expression in LPS-activated hippocampal nuerons MyD88:Myeloid differentiation facfor 88;TRAF6:TNF-αreceptor assoiated factor 6;LPS:Lipopolysaccharides;TLR4:Toll-like receptor 4*P<0.05,**P<0.01 vs normal group;#P<0.05,##P<0.01 vs LPSgroup
免疫熒光結(jié)果顯示,在正常對照組海馬神經(jīng)元中,NF-κB/P65主要表達在細胞質(zhì)(圖 5 A~C);LPS刺激后,大多數(shù) NF-κB/P65易位到胞核(圖5 E~F);而如果用LTR4抗體預處理培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元2h以后,再給以同樣濃度的LPS刺激,而LPS引起的NF-κB/P65核易位作用明顯減弱(圖5 G-I)。
Fig.5 Nuclear translocation of NF-κB/P65 of hippocampal nuerons in rats(Immunofluorescence×200)
2.4.1 LPS對海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中 TNF-α、IL-1β和NO的影響 為了探討LPS對海馬神經(jīng)元炎癥性細胞因子產(chǎn)生、釋放的影響,分別于 LPS刺激后 2、4、8、12、24 h收集培養(yǎng)上清液,ELISA法測定培養(yǎng)上清中 TNF-α、IL-1β和NO的濃度。與正常對照組相比,在 LPS刺激不同時間點后,其上清中 TNF-α、IL-1β和NO的濃度明顯上調(diào),有統(tǒng)計學差異 (P<0.05,P<0.01,圖 6)。
Fig.6 Effects of LPSon TNF-α,IL-1βand NO in culture supernatant LPS:Lipopoly saccharides;TNF-α:Tumor necrosis factor-α;IF-1β:Interleukin-1β;NO:Nitric oxide*P<0.05,**P<0.01 vs normal group
2.4.2 ELISA測定TLR4抗體預處理后LPS對海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和 NO的影響 結(jié)果可見,正常對照組培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和 NO釋放量較少。與正常對照組相比,LPS單一刺激組TNF-α、IL-1β和 NO釋放明顯增多(P<0.01)。預先用TLR4抗體阻斷則明顯減弱了由LPS作用而引起的 TNF-α、IL-1β和 NO的釋放(P<0.05,P<0.01,圖 7)。
Fig.7 Effects of anti-TLR4 on production of TNF-α,IL-1βand NO in LPS-activated hippocampal nuerons in culture supernatant TLR4:Toll-like receptor 4;TNF-α:Tumor necrosis factor-α;IF-1β:Interleukin-1β;NO:Nitric oxide*P<0.05,**P<0.01 vs normal group;#P<0.05,##P<0.01 vs LPSgroup
TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLR相關(guān)蛋白,一種模式識別受體,主要識別革蘭陰性菌細胞壁成分LPS,本實驗采用TLR4和Hoechst的雙重免疫熒光標記,鑒定TLR4在海馬神經(jīng)元的定位情況。結(jié)果表明,TLR4是一跨膜受體,定位于海馬神經(jīng)元的胞膜
[5]。
MyD88是TLR4信號通路中的一個關(guān)鍵接頭分子,在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。在抵抗病原體入侵的免疫應答啟動過程中TLR4介導的MyD88信號轉(zhuǎn)導通路能調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)基因的表達[8]。
本實驗采用RT-qPCR、Western blot法觀察海馬神經(jīng)元中 MyD88 mRNA、蛋白的表達。LPS激活TLR4實驗,結(jié)果可見:正常對照組海馬神經(jīng)元中,MyD88 mRNA和蛋白的表達相對較少,LPS刺激后,MyD88 mRNA和蛋白水平明顯高于正常對照組(P<0.05,P<0.01)。TLR4抗體阻斷實驗,結(jié)果可見:給以TLR4抗體預處理后,再給以與LPS單一刺激組相同濃度的LPS刺激,海馬神經(jīng)元MyD88 mRNA、蛋白的表達明顯低于 LPS單一刺激組(P<0.05)。結(jié)果提示:通過刺激海馬神經(jīng)元TLR4能促進MyD88的表達。
腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor associated factors,TRAFs)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族和 Toll樣/白細胞介素-1受體(Tool/IL-1 receptor,TIR)超家族重要的接頭分子。在MyD88依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑中,TRAF6是必需的連接分子[9]。
本實驗采用RT-qPCR、Western blot法觀察海馬神經(jīng)元中 TRAF6 mRNA、蛋白的表達。結(jié)果可見:LPS激活海馬神經(jīng)元TLR4后,正常對照組海馬神經(jīng)元中,TRAF6 mRNA和蛋白的表達相對較少,LPS刺激后,TRAF6 mRNA和蛋白水平明顯高于正常對照組,(P<0.05,P<0.01)。TLR4抗體阻斷實驗,結(jié)果可見:給以TLR4抗體預處理后,再給以與LPS單一刺激組相同濃度的LPS刺激,海馬神經(jīng)元TRAF6 mRNA、蛋白的表達明顯低于LPS單一刺激組(P<0.05)。結(jié)果提示:LPS通過激活 TLR4,增加海馬神經(jīng)元中TRAF6的表達。
NF-κB是TLR4的下游分子之一,一般是由p65和p50亞單位組成的異源二聚體。在未激活狀態(tài)下,NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合以無活性的形式存在于胞漿。有研究表明,在小膠質(zhì)細胞中,LPS激活TLR4后解除 IκB對 NF-κB的抑制作用、促進 NF-κB核易位、激發(fā)炎癥相關(guān)基因的表達,促進IL-1、TNF-α等合成和釋放[7]。
本實驗采用LPS刺激海馬神經(jīng)元,利用免疫熒光技術(shù)觀察NF-κB/p65核易位現(xiàn)象,在正常對照組海馬神經(jīng)元中,NF-κB/p65主要表達在細胞質(zhì),LPS刺激后,易位到細胞核;而如果用 TLR4抗體預處理海馬神經(jīng)元后,再以同樣劑量的 LPS刺激,則 LPS引起的 NF-κB/p65核易位作用明顯減弱。NF-κB/p65的核異位是 NF-κB活化的標志。結(jié)果提示,LPS能活化海馬神經(jīng)元 NF-κB,其發(fā)揮作用主要是通過核的易位來實現(xiàn)。
現(xiàn)有大量證據(jù)說明激活的免疫細胞可產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)如TNF-a、IL-1β和NO等,它們能導致腦內(nèi)神經(jīng)元的變性死亡,尤其是致炎細胞因子TNF-α和IL-1β在神經(jīng)退行性疾病中的作用受到廣泛關(guān)注
[10]。
本實驗采用 ELISA方法測定 LPS刺激海馬神經(jīng)元不同時間后培養(yǎng)上清中 TNF-α、IL-1β和NO的濃度。結(jié)果顯示,LPS刺激后,海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和 NO濃度逐漸升高,與正常組相比,LPS刺激 2、4、8、12、24 h組海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和NO的濃度均顯著或非常顯著高于正常對照組(P<0.05,P<0.01)。預先用 TLR4抗體處理海馬神經(jīng)元4 h后,再給予同樣劑量的LPS刺激,TNF-α、IL-1β和NO濃度顯著低于單用 LPS刺激組(P<0.05)。結(jié)果提示,LPS可以通過刺激海馬神經(jīng)元 TLR4,增加 TNF-α、IL-1β和 NO的分泌,增強腦內(nèi)的炎癥反應。
由此可見,海馬神經(jīng)元上有 TLR4的介導的MyD88依賴途徑,該途徑的激活參與了神經(jīng)炎癥反應。通過上述研究,期望在理論上為海馬神經(jīng)元TLR4及其信號通路在神經(jīng)炎癥方面提供更多的實驗依據(jù),為神經(jīng)炎癥炎癥學說增加新的知識。
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