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    自發(fā)性高血壓大鼠和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電流的比較*

    2013-03-30 02:06:14尚媛媛司軍強(qiáng)李新芝張忠雙馬克濤
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞膜平滑肌電流密度

    趙 磊,尚媛媛,司軍強(qiáng),李新芝,李 麗,張忠雙,馬克濤Δ

    (1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2.生理學(xué)教研室,3.病理生理學(xué)教研室,新疆石河子832002)

    以腦卒中為主的腦血管病是影響人類健康的主要疾病,高血壓是被公認(rèn)的腦卒中最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。眾所周知,血管緊張度增加是高血壓發(fā)病的關(guān)鍵,而微動(dòng)脈和小動(dòng)脈的肌源性張力是血管外周阻力及血壓形成的重要因素[1]。高血壓所致的顱內(nèi)大、小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和功能的改變是腦卒中發(fā)生的基礎(chǔ),在這一過程中,血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)內(nèi)的離子有著非常重要的作用。VSMCs膜上的離子通道對(duì)離子的異常轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用。研究發(fā)現(xiàn),包括腦動(dòng)脈(brain artery,BA)在內(nèi)的VSMCs上有Ca2+通道、K+通道、Cl-通道和非選擇性陽離子通道等多種離子通道的表達(dá)[2]。高血壓發(fā)展過程中,這些離子通道有可能發(fā)生變化,從而引起細(xì)胞內(nèi)離子濃度的異常,導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)和功能的改變。本研究通過比較研究自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)和正常 Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電流的異同,進(jìn)一步闡述高血壓形成機(jī)制。

    1 材料及方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    實(shí)驗(yàn)選用36周齡SHR大鼠及正常血壓Wistar大鼠,雌雄不拘,體重在(200~250)g,分別購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(許可證編號(hào)SCXK京2007-0001)和新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。用BP-6無創(chuàng)血壓監(jiān)測儀測量大鼠清醒安靜狀態(tài)下尾動(dòng)脈的血壓。

    1.2 標(biāo)本制備

    大鼠在麻醉狀況下放血處死,迅速取出腦,置于生理鹽溶液中,溶液成分如下(mmol/L):NaCl 138,KCl 5,CaCl21.6,MgCl21.2,Na-HEPES5,HEPES6,葡萄糖 7.5。在生理鹽溶液中,迅速取出 BA及其分支。

    單個(gè)平滑肌細(xì)胞制備:將微動(dòng)脈放置低Ca2+緩沖液中 20 min,低 Ca2+緩沖液成分為(mmol/L):NaCl 142、KCl 5、CaCl20.05、MgCl21、Na-HEPES 4、HEPES 5、葡萄糖7.5。在體顯微鏡下將微動(dòng)脈剪成幾段放入消化液中,在37℃溫箱中消化20~25 min,消化液成分包括(mg/ml):木瓜蛋白酶 0.75、膠原酶 IA 1、牛血清白蛋白 3.75、二硫蘇糖醇 0.3。離心(1 000 r/min,6 min)后棄上清液用低 Ca2+溶液替代,如此反復(fù)替換三次后,將液體移至用多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿上靜置30 min使細(xì)胞貼壁。

    1.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄

    在室溫條件下(22℃~25℃)使用Axon 700B放大器(Axon公司,美國)進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。記錄電極尖端直徑約為1μm,電極阻抗約為5 MΩ,由P-97拉制儀(Sutter公司,美國)拉制。電極內(nèi)液成分是(mmol/L):K-gluconate 130,NaCl 10,CaCl22.0,Mg-Cl21.2,HEPES 10,EGTA 5,葡萄糖 7.5。通過微操縱器接觸到細(xì)胞后給予負(fù)壓形成GΩ封接。補(bǔ)償電極電容后給予瞬時(shí)較強(qiáng)負(fù)壓或者電刺激擊破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞膜片鉗。膜電流用10 kHz低頻濾過。生物電信號(hào)通過 PC計(jì)算機(jī)記錄(Axoscope10.2軟件,Axon公司,美國)。采樣間隔為 10、20或 100 μs[3,4]。

    1.4 主要試劑

    所用藥物用生理鹽溶液配制,加藥通過切換開關(guān)控制,能保持灌流速度、溫度和其它成分不變。所用藥物有:4-aminopyridine(4-AP)、tetraethylammonium(TEA)由Sigma公司提供。其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    1.5 統(tǒng)計(jì)方法

    應(yīng)用SPSS16.0分析軟件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)(ˉx±s)表示,組間比較采用 t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 SHR和Wistar大鼠尾動(dòng)脈血壓的比較

    SHR大鼠的收縮壓為(189.3±6.7)mmHg,明顯高于正常 Wistar大鼠的收縮壓(117.6±5.4)mmHg(P<0.01)。

    2.2 SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞電流密度的異同

    圖1所示為應(yīng)用階躍電壓激活的SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞全細(xì)胞膜電流的異同。當(dāng)指令電壓為+60 mV時(shí),Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞電流幅度為(530±66)pA(n=35),電流密度為(44.3±6.0)pA/pF;SHR平滑肌細(xì)胞電流幅度為(1825±299)pA(n=35),電流密度為 (148.1±25.8)pA/pF。當(dāng)指令電壓為0、+20、+40和+60 mV時(shí),SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的電流密度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

    Fig.1 Comparison of the current density of VSMCs in BA between SHR and Wistar rats VSMCs:Vascular smooth muscle cells;BA:Brain artery;SHR:Spontaneously hypertensive rats*P<0.01 vs Wistar

    SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞膜電流都呈明顯的外向整流特性。電壓依賴的K+通道(voltage-gated K+channel,Kv)阻斷劑 4-AP(1 mmol/L)和大電導(dǎo)鈣激活K+通道(big conductance Ca2+-activated K+channel,BKCa)阻斷劑 TEA(1 mmol/L)對(duì)微動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的外向電流敏感(圖2),提示SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的外向電流部分主要是通過激活Kv通道和BKCa通道介導(dǎo)。

    2.3 SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞STOCs的異同

    34%(18/53)SHR和 22%(10/45)Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上都記錄到了自發(fā)性瞬時(shí)外向K+電流(spontaneous transient outward currents,STOCs),與Wistar大鼠相比,SHR的STOCs發(fā)放頻率和電流幅度都遠(yuǎn)大于 Wistar大鼠(圖3)。Wistar大鼠 STOCs的幅度及頻率(+40 mV)分別為(217±24)pA和(0.54±0.05)Hz,SHR STOCs的幅度及頻率分別為(423±57)pA和(0.83±0.07)Hz(n=16),分別增加了(57.2±14.3)% 和(64.3±16.8)%。

    Fig.2 Outward current of VSMCs in BA of SHR and Wistar rats are composed by Kv and BKCaA-B:1 mmol/L TEA and 1 mmol/L 4-APpartly inhibited the outward current respectively;Kv:Voltage-gated K+ channel;BKCa:Big conductance Ca2+-activated K+ channel

    Fig.3 Comparison of the STOCs of VSMCs in BA between SHR and Wistar rats A:Representative STOCs of VSMCs in BA of SHRand Wistar rats;B:Column graph presentation of the frequency and amplitude of STOCs in BA of SHR and Wistar rats;STOCs:Spontaneous transient outward K+ currents;SHR:Spontaneously hypertensive rats;BA:Brain artery*P<0.05 vs Wistar

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證STOCs的性質(zhì),觀察了1 mmol/L BKCa通道阻斷劑TEA和1 mmol/L Kv通道阻斷劑4-AP對(duì)STOCs的影響,TEA基本完全阻斷STOCs,而4-AP對(duì)STOCs沒有影響(圖4),提示 SHR和 Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上記錄到得STOCs由BKCa通道介導(dǎo)。

    3 討論

    Fig.4 STOCs of VSMCs mediated by BKCa A and B:1 mmol/L TEA almostly inhibited the STOCs,but not by 4-AP;STOCs:Spontaneous transient outward K+ current;VSMCs:Vascular smooth muscle cells;BKCa:Big conductance Ca2+-activated K+ channel;4-AP:4-aminopyridine

    在血管平滑肌細(xì)胞上主要表達(dá)四種K+通道,分別是內(nèi)向整流K+通道、ATP敏感K+通道、Kv和BKCa[5]。它們通過影響 VSMCs的膜電位調(diào)節(jié)血管的張力及直徑,同時(shí)受多種血管活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)在SHR和Wistar大鼠BA上平滑肌細(xì)胞的外向電流由Kv和BKCa組成,但兩種平滑肌細(xì)胞的電流密度存在差異,SHR平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流明顯高于正常大鼠。有研究發(fā)現(xiàn)在SHR的主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈及下肢動(dòng)脈都存在BKCa通道的活性增強(qiáng),且構(gòu)成BKCa通道的β1亞基的mRNA和蛋白的表達(dá)都高于正常大鼠[6],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。SHR平滑肌細(xì)胞上BKCa通道活性增強(qiáng)可能是由于電壓依賴性Ca2+通道開放導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高所致[7]。

    BKCa通道由膜去極化和細(xì)胞內(nèi)鈣離子所激活,通過對(duì)膜去極化和血管收縮的負(fù)反饋調(diào)節(jié)維持血管張力。BKCa通道受多種血管活性物質(zhì)(NO、前列腺素、內(nèi)皮素和血管緊張素II等)的調(diào)節(jié),通道活性及電流大小直接影響到血管的舒縮功能[8]。BKCa通道活性改變可引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的興奮及代謝調(diào)節(jié)等多種生理過程,其功能異常牽涉到高血壓等疾病的發(fā)生[9]。高血壓時(shí)平滑肌細(xì)胞肌源性張力增高與其去極化狀態(tài)有關(guān),作為阻力血管的腦動(dòng)脈,平滑肌細(xì)胞靜息膜電位改變與高血壓的發(fā)生更具有相關(guān)性。

    此外,本實(shí)驗(yàn)在SHR和Wistar大鼠BA平滑肌細(xì)胞上成功記錄到STOCs,且SHR的STOCs發(fā)放頻率和電流幅度都遠(yuǎn)大于Wistar大鼠,兩種平滑肌細(xì)胞上的STOCs都是由BKCa通道介導(dǎo)。STOCs發(fā)生起源于BKCa通道激活,與胞膜上10~100個(gè)左右的BKCa通道的同步開放相一致,低頻率的STOCs(1 Hz)即可明顯影響膜電位,平滑肌舒張。越來越多的研究表明由BKCa通道介導(dǎo)的STOCs在血管平滑肌的肌源性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,Jaggar JH[10]等研究發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣庫的開放可產(chǎn)生鈣火花,引起細(xì)胞內(nèi)局部、瞬時(shí)的[Ca2+]升高,進(jìn)而激活細(xì)胞膜上BKCa通道,產(chǎn)生 STOCs。STOCs可進(jìn)一步引起細(xì)胞膜超極化,抑制經(jīng)L型電壓依賴性Ca2+通道的Ca2+內(nèi)流,負(fù)反饋調(diào)節(jié)平滑肌收縮。

    總的來說,本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)SHR和Wistar大鼠BA平滑肌細(xì)胞的電流密度存在差異,SHR平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流明顯增強(qiáng),且更易誘發(fā)由 BKCa通道介導(dǎo)的 STOCs。BKCa通道和STOCs介導(dǎo)的K+外流引起血管平滑肌細(xì)胞超極化,血管舒張,降低外周血管阻力,反饋性的抑制血管張力,可能是阻止血壓升高的保護(hù)機(jī)制。

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