甘薯病毒病檢測技術(shù)研究

陳玉霞 谷 峰 張朝臣 周天虹 邵湘愉

（1湖北省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所 武漢 430064；2湖北省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所 武漢 430064）

甘薯是利用塊根和莖蔓繁殖的作物，因而易受病毒病的感染。目前已報道的甘薯病毒有10余種，主要有甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯潛隱病毒、甘薯黃矮病毒等[1]。甘薯感染病毒后，一般會在薯葉和薯塊上產(chǎn)生明顯病癥。病毒病是甘薯的重要病害，是導(dǎo)致甘薯產(chǎn)量降低和種性退化的主要原因之一，它廣泛存在于世界各甘薯產(chǎn)區(qū)。我國山東、江蘇、北京等地的調(diào)查顯示，由病毒病造成的甘薯產(chǎn)量損失一般達20%～30%，嚴重的可達 50%以上。作者曾在湖北省農(nóng)科院甘薯資源圃調(diào)查105個品種（品系），在湖北甘薯主產(chǎn)區(qū)咸寧、鄖陽、襄陽等地調(diào)查30多個品種（品系），結(jié)果表明，我省甘薯病毒病發(fā)病率高達61%，有的品種病株率甚至高達100%。甘薯病毒病已成為湖北省甘薯生產(chǎn)的限制因子之一。因此，對湖北省甘薯病毒病的檢測技術(shù)進行研究十分必要。本文通過癥狀診斷、病毒電鏡鑒定和巴西牽牛（IPOMOEA SETOSA）嫁接檢測三種方法對甘薯病毒病進行了初步研究，以尋求準確檢測診斷甘薯病毒病的方法。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備

電鏡為H-600，加速電壓75kv。

1.2 試驗材料

甘薯“99、1164、1030、1026”、5193等由湖北省農(nóng)科院甘薯組提供，南薯88采自恩施，巴西牽牛引自江蘇省徐州甘薯研究中心。

1.3 試驗方法

1.3.1 巴西牽牛種子處理

用小刀開破種殼，并用 0.5%硫酸銅浸泡10min，然后用清水浸泡48h，再倒去清水播種。

1.3.2 靠接

巴西牽牛和顯癥甘薯植株均用盆栽，植株長至一定長度后，將巴西牽牛和甘薯各一缽放在一起，在預(yù)備接合的部位（離土壤10cm～15cm處），一株向上作一切口，一株向下作一切口，然后將兩切口嵌在一起，用包裝帶包扎。待傷口愈合后，剪去甘薯植株的下部，讓其上部與巴西牽牛共生在一起，觀察并記錄巴西牽牛新生葉片的生長情況。此外還設(shè)兩株巴西牽牛作空白對照。一個多月后，即可將嫁接成功的巴西牽牛葉片、以及空白對照的巴西牽牛葉片取下進行電鏡鑒定。

1.3.3 電鏡觀察

取樣。剪下薯蔓浸泡在注入自來水的廣口瓶中，室溫下數(shù)日即可長根。取樣時間為電鏡觀察的前一天。取樣部位為病狀明顯的葉片，如皺縮花葉型、卷葉型、葉片斑點型等。植株如無明顯病狀則剪取第三片葉（從生長點往下數(shù)，已展開的第三片葉）。一般取葉中部的葉肉組織約1cm2，也可取葉柄和莖部組織。

負染法。將樣品（葉肉、莖或葉柄）剪下，放入研缽中，用剪刀剪碎，再研磨呈漿狀，立即加入數(shù)滴2%磷鎢酸，放置約1h。用帶有支持膜的銅網(wǎng)沾取研缽內(nèi)上層汁液，待其涼干后，在電鏡下觀察拍片。

超薄切片法。按常規(guī)超薄切片法，取病變?nèi)~片進行雙固定→乙醇系列脫水→浸透→包埋→切片→雙染→電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀診斷

當病毒侵染甘薯以后，一般會在甘薯植株上出現(xiàn)典型癥狀，這些癥狀是診斷甘薯病毒病的重要依據(jù)。湖北省甘薯病毒病主要的癥狀類型有三種[2]：

2.1.1 皺縮花葉型

幼葉具淺黃色斑塊，整個葉片皺縮粗糙，凸凹不平。發(fā)病嚴重者分枝較多，葉片發(fā)育不良，呈雞爪狀，葉緣呈波狀扭曲，有的葉片左右不對稱。表現(xiàn)皺縮花葉病癥的品種較多，占被調(diào)查品種的42%。

2.1.2 卷葉型

病苗葉片邊緣向上（個別向下）呈失水狀卷縮，嚴重者卷縮成杯狀。病葉成泡狀不平，并散生不規(guī)則黃斑或小黃圓斑。內(nèi)卷葉癥狀在春季苗期表現(xiàn)嚴重，夏季高溫期癥狀也不隱退，只是程度較苗期輕。

2.1.3 葉片斑點型

a）黃斑型。葉面散生小型黃色圓斑，直徑0.5mm～1.5mm，有的葉片邊緣不規(guī)則 ，散生褪綠半透明斑，呈油漬狀。

b）紫環(huán)斑型。秋涼后在病株的老葉上易出現(xiàn)紫色斑塊，有的斑塊中間黃綠色、外圍紫紅色，以后逐漸變成枯斑。

甘薯病毒病的癥狀表現(xiàn)受病毒種類、甘薯品種、生育期、環(huán)境條件等多種因素影響而復(fù)雜多變，因此，根據(jù)癥狀只能對甘薯病毒病作初步診斷[3]。

2.2 電鏡鑒定

表1 甘薯病毒電鏡鑒定結(jié)果

甘薯病毒電鏡鑒定是通過直接采取樣本肉眼觀察病毒粒子的形狀和大小，快速而直觀。

從表1來看，黃斑型、紫環(huán)斑型和卷葉型的甘薯病株葉片中存在線狀病毒粒子，其長度為1050 m～1 650m，形態(tài)和大小無明顯差異。

鏡檢皺縮花葉型病株6株，其中一株5193病葉中有長度為1 500m和1 150m長線狀病毒粒子，一株“99”病葉皺縮部位有長度為640m病毒粒子，在另一株“99”皺縮病株葉片中還發(fā)現(xiàn)許多類菌原體粒子，這種粒子橢圓形，直徑 117m～187m，在類菌原體的大小65 m～700 m范圍內(nèi)[4]，還有三株皺縮花葉型病株葉片中未發(fā)現(xiàn)病毒。

在電鏡觀察中還發(fā)現(xiàn)甘薯病葉汁液涂片中病毒濃度很低，在視野里很難發(fā)現(xiàn)病毒粒子，能觀察到時，在一個視野中也常只有1粒～2粒。

2.3 巴西牽牛嫁接檢測

2.3.1 嫁接檢測

嫁接檢測就是利用嫁接傳染進行檢測。嫁接傳染是利用接穗和砧木二者之間細胞的有機結(jié)合，使病毒從一個部分進入到另一個部分。巴西牽牛對多種侵染甘薯的病毒（SPFMV、SPMMV、SPLV、SPVMV、SPCLV）敏感，且受病毒侵染后，葉片上易產(chǎn)生系統(tǒng)癥狀，如沿葉脈網(wǎng)狀褪綠、葉面皺縮、褪綠斑及花葉等。

表2 甘薯病毒病巴西牽牛檢測結(jié)果

甘薯“1030”皺縮花葉病株與巴西牽牛嫁接后，88%巴西牽牛表現(xiàn)出癥狀，沿葉脈網(wǎng)狀褪綠，或沿主脈兩側(cè)褪綠，或主脈基部大塊黃斑，葉面普遍皺縮。與甘薯“99”皺縮花葉病株嫁接后的巴西牽牛67%表現(xiàn)出病狀，沿葉脈網(wǎng)狀退綠，葉面皺縮。甘薯“1164”內(nèi)卷葉病株和南薯88黃斑病株與巴西牽牛嫁接后，分別有86%和80%巴西牽牛出現(xiàn)病癥，其癥狀與甘薯病株癥狀基本一致。

2.3.2 電鏡驗證

用甘薯材料“99”、南薯88、5193與巴西牽牛嫁接，一個月后，將巴西牽牛新生葉片取下進行電鏡觀察，結(jié)果見表3。

從表3可以看出，表現(xiàn)皺縮花葉、紫環(huán)斑、葉面有褪綠半透明斑的甘薯病株與巴西牽牛嫁接后，巴西牽牛新生葉片出現(xiàn)沿葉脈褪綠、葉片皺縮且網(wǎng)狀褪綠等癥狀，電鏡檢測均有病毒，而表現(xiàn)正?；騼H僅表現(xiàn)葉片皺縮現(xiàn)象的甘薯植株與巴西牽牛嫁接后，巴西牽牛一般表現(xiàn)正常，電鏡檢測不到病毒。

利用靠接方法進行嫁接，甘薯植株和巴西牽牛的成活率達90%以上，此法用以檢測甘薯病毒靈敏、準確，簡便易行、成本低。

表3 甘薯病毒電鏡鑒定驗證巴西牽牛檢測結(jié)果

3 討論

3.1 在甘薯皺縮花葉型、卷葉型、黃斑型、紫環(huán)斑型病株葉片中觀察到的病毒粒子均為長線形，其長度為640m～1650 m。

3.2 甘薯皺縮花葉型病株葉片的電鏡觀察結(jié)果不穩(wěn)定，同一材料表現(xiàn)出不同的觀察結(jié)果，有時可觀察到病毒粒子，有時取材觀察又沒有。特別是具有明顯癥狀的材料，有時也全部未能發(fā)現(xiàn)病毒。這可能是由于甘薯病毒在體內(nèi)消長規(guī)律尚不清楚，取材制片方法不十分恰當所致。

3.3 一株用“1164”嫁接的巴西牽牛，在其顯癥葉片中發(fā)現(xiàn)線形病毒，其病毒濃度明顯高于甘薯病葉中病毒濃度。這是否由于寄主不同所致有待進一步研究。

3.4 在電鏡觀察中，還發(fā)現(xiàn)一株“99”的皺縮花葉型病葉中有疑為類菌原體存在，形狀為橢圓形粒子，直徑為117m～187m。但僅觀察到一次，以后多次觀察均未發(fā)現(xiàn)。

3.5 巴西牽牛與顯癥甘薯植株靠接后，葉片表現(xiàn)皺縮而且褪綠者，電鏡鑒定均有病毒存在，巴西牽牛嫁接傳毒的結(jié)果和病毒電鏡鑒定的結(jié)果基本相符。利用靠接方法進行嫁接，植株成活率達90%以上，而且傳毒率高，系統(tǒng)癥狀明顯，便于識別和診斷。所以，用巴西牽牛作指示植物對甘薯病毒病進行診斷是可行的。

[1] 張振臣,馬淮琴,張桂蘭.甘薯病毒病研究進展.河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2000(9):19～21

[2] 陳玉霞,張朝臣,周天虹,等.湖北省甘薯病毒病調(diào)查研究.湖北植保,2009(2):8～10

[3] 邢繼英,楊永嘉.甘薯病毒病檢測方法.植物保護,1995,21(2):38～40

[4] 陶正平.植物類菌原體及其純化方法簡介.植物保護,1990,16(1):43～44