響應(yīng)面法優(yōu)化木薯淀粉制備低聚異麥芽糖工藝

王鎮(zhèn)發(fā) 李夏蘭 陳培欽

（華僑大學(xué)化工學(xué)院生物工程系，廈門 361021）

低聚異麥芽糖（isomaltooligosaccharide，IMO），是淀粉糖的一種，主要成分為α－1，6－糖苷鍵結(jié)合的異麥芽糖（IG2）、潘糖（P）、異麥芽三糖（IG3）及四糖（含四糖）以上（Gn）的低聚糖［1］。低聚異麥芽糖具有促進(jìn)雙歧桿菌超強(qiáng)增殖、抗齲齒、消除疲勞、促進(jìn)鈣的吸收、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、潤(rùn)腸通便等生理功能［2－4］。又因其具有低甜度、低熱值、低黏度、保濕性、非發(fā)酵性、耐酸熱性等特性，所以被廣泛應(yīng)用于各類保健品、飲品、奶制品、糖果和面食等［5］。它是功能性低聚糖中產(chǎn)量最大，應(yīng)用最廣泛，集營(yíng)養(yǎng)、保健、療效于一體的被稱為21世紀(jì)的新型生物糖源。

以玉米淀粉為原料制備低聚異麥芽糖目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，但是以木薯淀粉為原料制備低聚異麥芽糖的研究較少。木薯淀粉的粗蛋白、脂肪和灰分含量比玉米淀粉少，而支鏈淀粉比玉米高，水解產(chǎn)物的分支低聚糖含量更高，這些特性對(duì)生產(chǎn)分支低聚糖都非常有利［6－8］。我國(guó)木薯資源豐富，利用木薯淀粉為原料采用多種酶聯(lián)合作用制備低聚異麥芽糖，可以大幅度提高木薯淀粉資源的附加值，同時(shí)為木薯資源的綜合利用開辟一條新的途徑。

1　材料與方法

1.1　原料與試劑

木薯淀粉：聚祥（廈門）淀粉有限公司。葡萄糖，麥芽糖，異麥芽糖，麥芽三糖，潘糖，異麥芽三糖：均為色譜純，美國(guó)sigma公司；乙腈：霍尼韋爾中國(guó)有限公司；耐高溫α－淀粉酶（酶活為68 U／mL，自制稀釋）、真菌α－淀粉酶（酶活為306 U／mL）、β－淀粉酶（酶活為13 U／mL）：諾維信中國(guó)有限公司；普魯蘭酶（酶活為11 U／mL，自制稀釋）：無錫杰能科生物工程有限公司；α－轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶（酶活為13 U／mL，自制稀釋）：日本天野制藥株式會(huì)社；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2　試驗(yàn)設(shè)備

Agilent1100高效液相色譜儀：美國(guó) Agilent公司；電熱恒溫振蕩水槽DKZ－2型：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；奧立龍CHNO60型pH計(jì)：上海華東電器集團(tuán)有限公司。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1 木薯淀粉制備低聚異麥芽糖工藝流程

需要說明的是，在木薯淀粉制備低聚異麥芽糖過程中糖化和轉(zhuǎn)苷的溫度和pH相同；低聚異麥芽糖的主要成分為異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖［9］，分析對(duì)象為這3種糖之和。

1.3.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)考慮了液化時(shí)間、糖化時(shí)間、真菌α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普魯蘭酶酶量、糖化轉(zhuǎn)苷溫度、糖化轉(zhuǎn)苷pH、α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量對(duì)異麥芽糖、潘糖以及異麥芽三糖之和（簡(jiǎn)稱：IG2＋P＋I(xiàn)G3）的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取真菌α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普魯蘭酶酶量、糖化轉(zhuǎn)苷溫度、糖化轉(zhuǎn)苷pH、α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量6個(gè)因素和IG2＋P＋I(xiàn)G3作為響應(yīng)值進(jìn)行6因素三水平的Box－Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)。采用高效液相色譜法分析異麥芽糖、潘糖以及異麥芽三糖的含量［1］。

1.3.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box－Behnken Design模型，對(duì)上述6個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，并對(duì)所獲得的響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與討論

2.1　單因素試驗(yàn)

液化時(shí)間從50到190 min，IG2＋P＋I(xiàn)G3在不斷降低，這是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加淀粉液化的DE值不斷增加，而低的DE值有利于生成較多的低聚異麥芽糖和較少的葡萄糖；又當(dāng)液化時(shí)間為40 min時(shí)液化后的木薯淀粉液很容易退化，不易進(jìn)行試驗(yàn)，所以液化時(shí)間選為50 min。糖化時(shí)間從0～8 h，間隔2 h做一組試驗(yàn)，結(jié)果糖化時(shí)間為4 h時(shí)IG2＋P＋I(xiàn)G3最大且所用時(shí)間最短。糖化轉(zhuǎn)苷在pH 4.0～5.4這個(gè)范圍內(nèi)，IG2＋P＋I(xiàn)G3隨著pH的增大而增加；當(dāng)pH大于5.4，IG2＋P＋I(xiàn)G3隨著pH的增大而減少。糖化轉(zhuǎn)苷溫度范圍35～60℃，在40℃時(shí)IG2＋P＋I(xiàn)G3最大。當(dāng)β－淀粉酶添加量從0～0.20 mL時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3隨著添加量的增加而迅速增加；當(dāng)添加量大于0.20 mL時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3稍微減少一些，當(dāng)添加量大于0.30 mL時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3趨向平衡，基本不變。當(dāng)普魯蘭酶添加量從0～0.20 mL時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3隨著添加量的增加而迅速增加；當(dāng)添加量大于0.20 mL時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3隨之減少。當(dāng) α－淀粉酶添加量從0～0.30 mL時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3隨著添加量的增加而迅速增加；當(dāng)添加量大于0.30 mL時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3稍微減少一些，當(dāng)添加量大于0.40 mL時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3趨向平衡，基本不變。當(dāng)α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶添加量從0.02～0.10 mL時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3隨著添加量的增加而迅速增加；當(dāng)添加量大于0.10 mL時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3隨著添加量的增加而減少。

2.2　Box－Behnken試驗(yàn)

根據(jù)單因素考察結(jié)果選取溫度（X1，℃）、pH（X2）、α－淀粉酶酶量（X3，mL）、β－淀粉酶酶量（X4，mL）、普魯蘭酶酶量（X5，mL）和 α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量（X6，mL）作為考察因素，采用 Box－Behnken法6因素3水平進(jìn)行試驗(yàn)，以IG2＋P＋I(xiàn)G3（R，mg／mL）作為響應(yīng)值。試驗(yàn)安排及試驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)安排表及結(jié)果

利用Design Expert軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得以IG2＋P＋I(xiàn)G3對(duì)溫度、pH、α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普魯蘭酶酶量和α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量的二次多項(xiàng)回歸方程：R＝101.22－5.37X1＋3.05X2＋1.61X3－0.61X4＋2.47X5－6.16X6＋2.70X1X2－2.48X1X3＋0.31X1X4－1.79X1X5－0.55X1X6－2.03X2X3＋2.43X2X4－2.02X2X5＋5.47X2X6＋0.74X3X4＋1.14X3X5－0.018X3X6－0.89X4X5－1.55X4X6＋0.57X5X6－10.17X12－11.50X22－5.33X32－2.95X42－7.09X52－7.21X62

從回歸模型方差（表2）可知，試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型 F值為9.033，“Prob＞F”＜0.000 1，具有顯著性；失擬項(xiàng)為0.158 0，影響不顯著，說明模型不失擬；整個(gè)模型R2＝0.907 0，變異系數(shù)5.79%，表明方程的因變量與全體自變量之間的回歸效果顯著，此模型擬合較好。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表 2方差分析結(jié)果可知，X1、X2、X5、X6、X2X6、X12、X22、X32、X52、X62對(duì)生成IG2＋P＋I(xiàn)G3有顯著或極顯著的影響，其他因素影響相對(duì)較小；方程的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)（P＜0.05）比較顯著，因素的交叉項(xiàng)（P＞0.05）相互作用不顯著，說明各個(gè)具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響是二次拋物面的關(guān)系，而各個(gè)因素之間的交互作用在試驗(yàn)中影響不大。

2.3　響應(yīng)面分析

通過Design－Expert統(tǒng)計(jì)分析軟件作響應(yīng)曲面，可以直觀地分析溫度、pH、α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普魯蘭酶酶量和α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量6個(gè)因素之間交互作用對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響，結(jié)果見圖1～圖15所示。

從圖1可知，IG2＋P＋I(xiàn)G3量受pH和溫度共同影響，隨著pH的增大，IG2＋P＋I(xiàn)G3量不斷增加，但pH超過5.5，則不利于IG2＋P＋I(xiàn)G3量的增加；隨著溫度的升高，IG2＋P＋I(xiàn)G3量不斷增加，在40℃左右達(dá)到最大值，之后隨著溫度的升高，IG2＋P＋I(xiàn)G3量不斷下降；pH 5.50，溫度為40℃時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3量達(dá)到最大值。從圖2可知，IG2＋P＋I(xiàn)G3量受α－淀粉酶酶量和溫度共同影響，當(dāng)溫度為35℃或者55℃時(shí)，增加α－淀粉酶酶量對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3量的增加影響不大；當(dāng)溫度為40℃、α－淀粉酶酶量為0.25 mL（76.5 U）時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3量達(dá)到最大。從圖3可知，β－淀粉酶酶量與溫度相比，溫度的改變對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3量的影響更大；當(dāng)溫度為45℃、β－淀粉酶酶量為0.15 mL（1.95 U）時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3量達(dá)到最大。從圖4可知，IG2＋P＋I(xiàn)G3量受普魯蘭酶酶量和溫度共同影響，當(dāng)普魯蘭酶酶量為0.25 mL（2.75 U）、溫度為45℃時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3量達(dá)到最大。從圖5可知，IG2＋P＋I(xiàn)G3量受α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量和溫度共同影響，當(dāng)α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量為0.10～0.15 mL（1.3～1.95 U）、溫度為40～45℃時(shí)，IG2＋P＋I(xiàn)G3量達(dá)到最大。從圖6至圖9可知，IG2＋P＋I(xiàn)G3量受α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普魯蘭酶酶量、α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶和溫度共同影響，適當(dāng)?shù)拿噶亢蜏囟扔欣贗G2＋P＋I(xiàn)G3量的增加。從圖10可知，α－淀粉酶和β－淀粉酶相互作用對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響不大。從圖11可知，普魯蘭酶酶量的變化比α－淀粉酶酶量的變化對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3量的影響更大。從圖12可知，α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量的變化比α－淀粉酶酶量的變化對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3量的影響更大。從圖13可知，普魯蘭酶酶量的變化比β－淀粉酶酶量的變化對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響更大。從圖14可知，α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量的變化比β－淀粉酶酶量的變化對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3量的影響更大。從圖15可知，α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶和普魯蘭酶共同影響IG2＋P＋I(xiàn)G3的量，α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量為0.10～0.15 mL（1.3～1.95 U）、普魯蘭酶酶量為0.25～0.35 mL（2.75～3.85 U）時(shí)，更有利于IG2＋P＋I(xiàn)G3量的增加。從上述分析可知pH和溫度與酶的相互影響比較大，酶與酶之間的相互影響比較小。

圖1　pH和溫度對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖2　α－淀粉酶和溫度對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖3　β－淀粉酶和溫度對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖4　普魯蘭酶和溫度對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖5　α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶和溫度對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖6　α－淀粉酶和pH對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖7　β－淀粉酶和pH對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖8　普魯蘭酶和pH對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖9　α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶和pH對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖10　α－淀粉酶和β－淀粉酶對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖11　普魯蘭酶和α－淀粉酶對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖12　α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶和α－淀粉酶對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖13　普魯蘭酶和β－淀粉酶對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖14　α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶和β－淀粉酶對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

圖15　α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶和普魯蘭酶對(duì)IG2＋P＋I(xiàn)G3的影響

2.4　優(yōu)化工藝條件驗(yàn)證

通過Design－expert軟件建立模型分析，得出以木薯淀粉（30%）為原料制備低聚異麥芽糖的最佳工藝條件：糖化轉(zhuǎn)苷溫度為41.9℃，糖化轉(zhuǎn)苷pH 5.45，真菌α－淀粉酶酶量為30.60 U／g（淀粉）、β－淀粉酶酶量為1.04 U／g（淀粉）、普魯蘭酶酶量為1.10 U／g（淀粉）和α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量為0.48 U／g（淀粉）。液化條件固定為：耐高溫α－淀粉酶酶量為2.27 U／g（淀粉）、液化時(shí)間為50 min、液化溫度為90℃、液化pH 6.2。該條件下反應(yīng)24 h，IG2＋P＋I(xiàn)G3的預(yù)測(cè)值為103.8 mg／mL。采用上述優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，為104.3 mg／mL，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差0.48%。可見此模型可以較好地預(yù)測(cè)IG2＋P＋I(xiàn)G3的量。

3　結(jié)論

在研究單因素影響IG2＋P＋I(xiàn)G3的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用Box－Behnken法響應(yīng)面優(yōu)化。響應(yīng)面優(yōu)化模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著。優(yōu)化后6個(gè)因素糖化轉(zhuǎn)苷溫度為41.9℃，糖化轉(zhuǎn)苷pH 5.45，真菌α－淀粉酶酶量為30.60 U／g（淀粉）、β－淀粉酶酶量為1.04 U／g（淀粉）、普魯蘭酶酶量為 1.10 U／g（淀粉）和α－轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶量為0.48 U／g（淀粉）。該條件下IG2＋P＋I(xiàn)G3為104.3mg／mL，即異麥芽糖、潘糖以及異麥芽三糖總和為0.417 2 g／g（淀粉），與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.48%。說明該模型具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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