實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的生物安全問(wèn)題

賈曉娟，黃力勤，劉文軍

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2012年1月20日，國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊Nature 和Science 同時(shí)發(fā)表了一份聯(lián)合聲明：39位流感研究者聲明在60 d 內(nèi)暫停實(shí)驗(yàn)室突變H5N1禽流感病毒的研究工作。這一聲明引發(fā)了科研工作者對(duì)實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒潛在的生物安全問(wèn)題的重視和思考。我們尊重和鼓勵(lì)科學(xué)家利用重構(gòu)流感病毒的方法探索其致病機(jī)理，但也應(yīng)高度重視重構(gòu)流感病毒潛在的生物風(fēng)險(xiǎn)[1-2]，應(yīng)當(dāng)對(duì)重構(gòu)病毒的生物安全和防范措施進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并權(quán)衡相關(guān)研究的科學(xué)意義和社會(huì)價(jià)值。

1 流感病毒簡(jiǎn)介

流感病毒是一種造成人及動(dòng)物患流行性感冒的RNA 病毒，在分類學(xué)上屬于正黏病毒科，根據(jù)其內(nèi)部核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的抗原性不同，可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中甲型流感病毒在禽類和哺乳動(dòng)物中廣泛存在，也是目前引起人類和各種動(dòng)物流感的主型。甲型流感病毒根據(jù)血凝素(Hemagglutinin,H)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,N)抗原不同，又分為許多亞型，H 可分為15個(gè)亞型(H1～H15)，N 分為9個(gè)亞型(N1～N9)，其中僅H1N1和H3N2主要感染人類，其他許多亞型的自然宿主是多種禽類和動(dòng)物，其中對(duì)禽類危害最大的是H5、H7和H9亞型毒株。甲型流感病毒基因組有8個(gè)RNA 片段構(gòu)成，它們編碼了14個(gè)病毒蛋白：聚合酶蛋白(PB1、PB2和PA)[3-4]、核蛋白(NP)、血凝素蛋白(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質(zhì)蛋白(M1和 M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)、核輸出蛋白(NEP)，以及最近報(bào)道的PB1-F2、PB1-N40、PA-X 和M42蛋白[3-6]。

流感病毒會(huì)造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速傳播，引發(fā)世界各地周期性的大流行。每年世界范圍內(nèi)因季節(jié)性流感導(dǎo)致的死亡人數(shù)約超過(guò)5萬(wàn)人[7]。除季節(jié)性流感外，廣泛流行的流感病毒株可以在短時(shí)間內(nèi)造成全球性感染，例如，1918年的西班牙大流感，兩年之內(nèi)導(dǎo)致全球超過(guò)5000萬(wàn)人死亡[8]；2009年暴發(fā)的H1N1大流感感染量超過(guò)2000萬(wàn)人。一些流感病毒可以通過(guò)跨種間傳播感染人類，最典型的是亞洲禽流感病毒 H5N1和今年新發(fā)現(xiàn)的H7N9。其中，H5N1雖具有極高的致死率(約占感染者的56%)，但卻不能在人群中有效傳播，2003?2006年，全球僅有263例感染病例[9]。2013年3月底，我國(guó)出現(xiàn)的H7N9流感病毒是由來(lái)自東亞地區(qū)的野鳥和中國(guó)上海、浙江、江蘇雞群的流感病毒基因重組產(chǎn)生的[10]。截至2013年5月6日，我國(guó)內(nèi)地已確診H7N9感染病例129例，其中31人死亡。

甲型流感病毒含有的8個(gè)基因片段極易發(fā)生突變和重組，這是新型流感病毒的產(chǎn)生和跨種間傳播的主要原因。基因突變?nèi)菀自斐闪鞲胁《綡A 和NA 蛋白抗原性變化，即抗原飄移，基因突變?cè)斐闪鞲胁《咀儺惖某潭容^?。欢蛑亟M會(huì)使流感病毒的表面抗原發(fā)生根本轉(zhuǎn)換，即抗原轉(zhuǎn)換?；蛑亟M會(huì)產(chǎn)生新型流感病毒，這也是流感病毒跨種間傳播以及導(dǎo)致感染不可預(yù)測(cè)和反復(fù)持續(xù)的主要原因。

2 流感病毒的實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)

為了探索流感病毒跨種間傳播的分子機(jī)制以及影響流感病毒感染力和致病力的分子機(jī)理，科學(xué)家采用反向遺傳操作技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室模擬自然環(huán)境中流感病毒基因重組的過(guò)程構(gòu)建出新型流感病毒。他們希望借助這一研究手段揭示流感病毒跨種間感染機(jī)理和不同亞型流感病毒感染力和致病力存在巨大差異的原因。目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的研究工作主要是對(duì)H5型病毒進(jìn)行重構(gòu)實(shí)驗(yàn)，目前世界上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建出了可以在哺乳動(dòng)物傳播的 H5型流感病毒[11-13]，這對(duì)于揭示H5型流感病毒跨種間傳播的分子機(jī)制以及對(duì)流感病毒的預(yù)防和控制具有重要意義。

2011年底，荷蘭伊拉斯姆斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(Erasmus Medical Center)的榮·費(fèi)奇(Ron Fouchier)及其同事向Science 雜志提交了一份研究論文，文章指出他們?cè)趯?shí)驗(yàn)室里對(duì)禽流感病毒H5N1只需進(jìn)行5次基因的人工變異，便可以使之具有在哺乳動(dòng)物雪貂間傳播的易感性[11]。這5種變異此前已經(jīng)分別在自然界中獨(dú)立觀察到過(guò)。無(wú)獨(dú)有偶，2012年，美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的河岡義裕(Yoshiro Kawaoka)及其同事也在另一本權(quán)威科學(xué)雜志——Nature 發(fā)表了一篇文章，報(bào)告了類似的研究結(jié)果[12]。2013年5月，Zhang 等在Science 雜志上發(fā)表了將H5N1型和H1N1型流感毒株進(jìn)行基因重配的文章[13]，其研究是通過(guò)將H5N1型流感病毒與2009年引發(fā)大流感的H1N1型流感病毒進(jìn)行基因重配，包裝出127株重構(gòu)流感毒株，研究介紹了人工重構(gòu)病毒的傳播能力，并希望以此研發(fā)新型抗流感病毒疫苗。

上述研究成果對(duì)于闡明流感病毒跨種間傳播的分子機(jī)制以及不同病毒感染力和致病力差異的分子機(jī)理具有重要意義，但重構(gòu)病毒潛在的風(fēng)險(xiǎn)危害也令人擔(dān)憂。這些重構(gòu)毒株在鑒定為無(wú)害或確定安全等級(jí)之前，都存在著可預(yù)見或潛在的生物風(fēng)險(xiǎn)因素，如：某些基因毒株或基因片段帶有致病基因、抗藥基因等，倘若實(shí)驗(yàn)者缺乏足夠的安全意識(shí)使之進(jìn)入到環(huán)境中，一旦在外界環(huán)境中發(fā)生突變或與環(huán)境中的物種發(fā)生基因重組等，便很可能造成嚴(yán)重的生物災(zāi)害。這一擔(dān)憂在上述榮·費(fèi)奇和河岡義裕兩個(gè)研究小組公布研究成果后更是達(dá)到了頂峰。他們的研究引起了科學(xué)界和社會(huì)的巨大恐慌，人們不禁思索這是否意味著可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)室基因重組的方法構(gòu)造出新的流感病毒？實(shí)驗(yàn)重構(gòu)的流感病毒如何處置？現(xiàn)有的生物安全防護(hù)條件和科研管理是否可以有效防控重構(gòu)流感病毒的擴(kuò)散？

2012年2月，世界衛(wèi)生組織在日內(nèi)瓦召開了一個(gè)閉門會(huì)議，包括榮·費(fèi)奇和河岡義裕兩名科研成果處于爭(zhēng)議的科學(xué)家在內(nèi)的22名來(lái)自科學(xué)界和出版界的專家參加了此會(huì)。會(huì)議最后決定暫停流感病毒相關(guān)研究60 d，以給科學(xué)家和生物安全管理者足夠的時(shí)間辯論，確定如何能在保障生物安全的前提下持續(xù)此類研究，實(shí)驗(yàn)室采取哪些措施能避免重構(gòu)病毒的生物危害[14]。

3 實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的生物安全防護(hù)

科學(xué)界和公眾對(duì)實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的恐懼和擔(dān)憂主要表現(xiàn)為以下5點(diǎn)：1)重構(gòu)出的流感病毒是否具有更高的感染性和致病力，是否潛在生物危害？2)重構(gòu)的流感病毒是否會(huì)從實(shí)驗(yàn)室傳播到自然環(huán)境，導(dǎo)致流感的大暴發(fā)？3)從事重構(gòu)流感病毒工作的科研工作者是否具有生物安全層面的職業(yè)操守和自律意識(shí)？4)如何防止恐怖分子利用公開發(fā)表的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)制造出新型病毒危害社會(huì)？5)國(guó)外研究者是否會(huì)質(zhì)疑此類研究屬于“生物戰(zhàn)劑”的研制范疇，從而阻礙其他相關(guān)科研項(xiàng)目的順利開展？因此，科學(xué)家和科研管理者有必要在實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒項(xiàng)目立項(xiàng)前，權(quán)衡其研究的科學(xué)意義和風(fēng)險(xiǎn)危害，并確保批示項(xiàng)目具備完善的生物安全保障體系。目前國(guó)內(nèi)外主要從實(shí)驗(yàn)室防護(hù)和制度管理兩方面保障實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的安全防護(hù)體系[15]，本文將對(duì)此兩方面提出相關(guān)建議。

3.1 重構(gòu)流感病毒的實(shí)驗(yàn)室防護(hù)

3.1.1 加強(qiáng)重組流感病毒實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

建議對(duì)實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)在實(shí)驗(yàn)操作、重構(gòu)毒株、儀器設(shè)備、管理制度等方面均進(jìn)行動(dòng)態(tài)的生物危害風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。根據(jù)我國(guó)《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》(國(guó)務(wù)院第424號(hào)令)、《人間傳染的病原微生物名錄》、《重組DNA 實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例》等相關(guān)條例、要求確定原始毒株和重組毒株的危害等級(jí)，并按規(guī)定選擇在相應(yīng)等級(jí)的生物安全實(shí)驗(yàn)室開展實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。對(duì)實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)進(jìn)行生物危害風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估主要基于以下3個(gè)原因：

1)流感病毒中有些毒株屬于高致病性病原微生物，例如：H5N1禽流感病毒屬于甲型流感病毒的一個(gè)高致病型亞型，按照《人間傳染的病原微生物名錄》劃分，屬于危害等級(jí)為二類的病原微生物，具有跨種間傳播特性，可導(dǎo)致人和動(dòng)物患病，且有很高的致死率，因此其相關(guān)重組實(shí)驗(yàn)均具有一定的生物風(fēng)險(xiǎn)；2)流感病毒是一種經(jīng)空氣傳播感染呼吸道的病毒，在實(shí)驗(yàn)操作中病毒極易擴(kuò)散到空氣中，存在潛在重構(gòu)流感病毒向自然環(huán)境擴(kuò)散甚至感染人類的生物風(fēng)險(xiǎn)；3)重構(gòu)流感病毒可能產(chǎn)生新型耐藥株和強(qiáng)毒株[16]，而目前缺少對(duì)重構(gòu)毒株防控和感染治療的有效手段，比如：現(xiàn)有人用H5N1禽流感疫苗不能保證對(duì)所有實(shí)驗(yàn)操作人員均具有很好的免疫保護(hù)效果，且對(duì)重組毒株的免疫效果未知。

3.1.2 加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室重組流感病毒的等級(jí)防護(hù)

實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的出發(fā)毒株常為從感染病例中分離得到的野生型毒株，基于野生型流感病毒與重構(gòu)后病毒的差異以及對(duì)重構(gòu)病毒感染性和致病力的未知，建議在生物安全三級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室中從事流感病毒的重構(gòu)實(shí)驗(yàn)。生物安全四級(jí)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)、設(shè)備設(shè)施、安全操作規(guī)程等安全體系適用于對(duì)人體具有高度危險(xiǎn)性、通過(guò)氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明、目前尚無(wú)有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。比如：重構(gòu)H5N1流感病毒具有人與人之間傳播的可能性，結(jié)合H5N1的高致死率，一旦發(fā)生病毒泄露，會(huì)造成大量的人員死亡，而生物安全四級(jí)實(shí)驗(yàn)室相比三級(jí)實(shí)驗(yàn)室有著更安全的防護(hù)設(shè)施[17-18]，如：實(shí)驗(yàn)人員需要穿戴正壓服，同時(shí)需要進(jìn)行更嚴(yán)格的消毒滅菌等，這些設(shè)施最大程度地保證了對(duì)重構(gòu)病毒的安全防護(hù)，但僅有設(shè)備和系統(tǒng)上的防護(hù)對(duì)于保障整個(gè)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的安全體系也是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足的。2004年下半年臺(tái)灣和新加坡先后發(fā)生急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)實(shí)驗(yàn)室感染事件[19]；據(jù)美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)統(tǒng)計(jì)，2003?2009年，美國(guó)的生物安全實(shí)驗(yàn)室共發(fā)生過(guò)395起生物安全事故，其中7起事故源于實(shí)驗(yàn)室改造生物的泄露。因此，我們建議在加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的防護(hù)工作時(shí)，也應(yīng)注意提高相關(guān)科研工作者生物安全層面的防范意識(shí)和自律意識(shí)[20-23]。

當(dāng)然，可能目前我們對(duì)實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的恐懼是多余的，這種過(guò)分擔(dān)憂在歷史上也曾發(fā)生，如1979年，單純皰疹病毒的胸苷激酶基因克隆實(shí)驗(yàn)要求必須在生物安全四級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，因?yàn)楫?dāng)時(shí)認(rèn)為這一實(shí)驗(yàn)具有很高的潛在生物危害，現(xiàn)在我們明白這一危險(xiǎn)是不存在的[24]，同樣的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)在生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室就可以進(jìn)行。所以，未來(lái)我們可能獲得預(yù)防和治療流感更有效的方法，重構(gòu)流感病毒實(shí)驗(yàn)也無(wú)需在高等級(jí)的生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，但基于目前研究的未知現(xiàn)狀，我們還是應(yīng)當(dāng)從意識(shí)和行動(dòng)上加強(qiáng)對(duì)流感病毒重構(gòu)實(shí)驗(yàn)的生物安全防護(hù)。

3.2 實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒的生物安全管理防護(hù)

實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒研究結(jié)果的公開發(fā)表具有被恐怖分子參考利用制造生物恐怖事件的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，國(guó)際社會(huì)有必要制定出一套行之有效的管理和防范措施健全實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)病毒的生物安全管理體系。

早在1992年，我國(guó)作為第一批締約方簽署了聯(lián)合國(guó)《生物多樣性公約》，在此框架下，于2000年通過(guò)了《卡塔特生物安全議定書》，表明要與世界各國(guó)共同致力于國(guó)際生物安全的管理工作[25]。之后，為了加強(qiáng)病原微生物生物安全領(lǐng)域的學(xué)術(shù)和技術(shù)交流，保障安全有效地從事病原微生物相關(guān)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，各個(gè)國(guó)家相繼成立了生物安全委員會(huì)，并積極舉辦和參與國(guó)際性、區(qū)域性生物安全協(xié)會(huì)的交流活動(dòng)。我國(guó)也于1979年和2012年分別成立了中國(guó)微生物學(xué)會(huì)病毒學(xué)專業(yè)委員會(huì)和微生物生物安全專業(yè)委員會(huì)，這標(biāo)志著我國(guó)病原微生物生物安全工作進(jìn)入了一個(gè)嶄新階段。目前我國(guó)已制定和頒布了《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》、《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》、《基因工程安全管理辦法》等相關(guān)法律法規(guī)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全的防護(hù)和管理提出了要求，但這些法律法規(guī)的實(shí)施和可操作性有待進(jìn)一步加強(qiáng)。《基因工程安全管理辦法》于1993年12月發(fā)布實(shí)施，至今已近20年。此間，生物技術(shù)飛速發(fā)展，其涉及的基因工程范圍、深度及生物安全問(wèn)題發(fā)生了明顯改變，人們對(duì)生物安全的認(rèn)識(shí)亦在不斷加深，隨著重組基因技術(shù)的日趨發(fā)展和完善，重組病毒帶來(lái)的生物安全問(wèn)題可能越來(lái)越多、越來(lái)越復(fù)雜，這就需要建立和健全一套行之有效的生物安全管理和監(jiān)督制約制度，而目前我國(guó)基因重組相關(guān)的法律法規(guī)缺少可操作性，其中所提出的生物安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、項(xiàng)目申報(bào)和審批等重要內(nèi)容，尚未具體落實(shí)，這就亟需政府和社會(huì)各階層統(tǒng)一行動(dòng)，盡快修訂和完善《基因工程管理辦法》等相關(guān)法律法規(guī)，落實(shí)和加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室生物安全管理。本文從建立和健全相關(guān)法律法規(guī)、基因工程項(xiàng)目審批、生物安全組織管理模式、提高科研人員和公眾生物安全意識(shí)4方面提出建議。

1)建議成立或組織專門機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)基因工程生物制品的研究和生產(chǎn)中生物安全有關(guān)規(guī)定、實(shí)施細(xì)則的制定、完善和及時(shí)更新；建議加強(qiáng)法律和公約約束，要求從事實(shí)驗(yàn)室重組病毒研究的科研工作者履行相應(yīng)的生物安全國(guó)際公約，并在開展實(shí)驗(yàn)前簽署相關(guān)協(xié)議并發(fā)表生物安全聲明。

2)建議設(shè)立組織機(jī)構(gòu)對(duì)實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)病毒研究項(xiàng)目進(jìn)行立項(xiàng)前的生物安全審查、審批，要求涉及基因重組的科研課題必須在項(xiàng)目準(zhǔn)入前盡可能全面地提供生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告、實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、應(yīng)急預(yù)案及防控措施等，并由該組織機(jī)構(gòu)進(jìn)行初評(píng)。

3)建議加強(qiáng)科教文衛(wèi)農(nóng)等相關(guān)部門生物安全管理的溝通與合作，避免“管理斷層”，同時(shí)整合社會(huì)各階層生物安全管理的優(yōu)勢(shì)資源，將流感研究的生物安全監(jiān)督和管理工作建成體系；將此工作滲入到流感防控的各項(xiàng)工作中，并使其制度化、常態(tài)化和長(zhǎng)效化。

4)建議充分發(fā)揮相關(guān)學(xué)會(huì)、專業(yè)委員會(huì)的民間團(tuán)體作用，聯(lián)合政府、社會(huì)各機(jī)構(gòu)做好科普宣傳工作，警示和提高流感科研工作者生物安全層面的倫理道德、職業(yè)操守和自律意識(shí)，提高公眾對(duì)“兩用性”科研成果的敏感性和主動(dòng)監(jiān)督意識(shí)。

4 總結(jié)與展望

實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒是把“雙刃劍”，一方面對(duì)于揭示流感病毒跨種間傳播的分子機(jī)制、闡明不同毒株具有不同感染力和致病力的分子機(jī)理以及研發(fā)新型抗流感藥物具有重要意義；另一方面卻存在著重構(gòu)出強(qiáng)毒株、耐藥株以及病毒泄露引發(fā)新型流感大流行的生物風(fēng)險(xiǎn)。如何評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室重構(gòu)流感病毒研究的科學(xué)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值是值得廣大科研工作者深思的課題。生物安全相關(guān)政策、管理制度的健全和完善最終體現(xiàn)為科研工作者的操作規(guī)范，因此，從事流感研究的科研人員應(yīng)當(dāng)明確科研目的和社會(huì)責(zé)任，將生物安全意識(shí)貫穿于整個(gè)流感病毒研究工作的始終，充分體現(xiàn)科學(xué)家的價(jià)值觀和使命感，盡可能規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)，體現(xiàn)重構(gòu)流感病毒科學(xué)研究的社會(huì)意義。

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