槲皮素對(duì)兔離體腸平滑肌的舒張作用及其機(jī)制*

張 佳，邵正威，高 雅，王巧云

（1.濱州醫(yī)學(xué)院口腔學(xué)院，2.濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 煙臺(tái)264000）

槲皮素（quercetin，3，3’，4’，5，7-pentahydroxyflavone）是一種多羥基黃酮類化合物，化學(xué)名為3，3’，4’，5，7—五羥基黃酮，廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)中，如菊花、絞股藍(lán)、山碴、銀杏葉等，具有抗氧化及清除自由基、抗纖維化、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖、降壓、心血管保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛及止瀉等廣泛藥理作用［1-3］。近年研究表明，槲皮素能夠抑制正常小鼠胃排空及小腸推進(jìn)［4-5］，但其作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過離體家兔小腸平滑肌灌流方法，進(jìn)一步探討不同濃度槲皮素對(duì)離體腸平滑肌收縮活動(dòng)的影響及其作用機(jī)制，以期為槲皮素在消化系統(tǒng)疾病治療方面的研發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

槲皮素（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度為98%，批號(hào)ZL20091211），實(shí)驗(yàn)時(shí)將槲皮素用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配成藥液備用。釕紅（ruthenium red，RR）、Bay K8644、肝素（heparin，HP）和左旋硝基精氨酸甲酯（nitro-L-argininemethylester，L-NAME）均購(gòu)自 Sigma公司；氯化乙酰膽堿（acetylcholine chloride，Ach，批號(hào) 091201，中科院上海生物化學(xué)研究所試劑廠）。磷酸組胺（histamine phosphate，中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所）。氯化鋇（BaCl2，自貢市張家壩鹽華有限公司）。實(shí)驗(yàn)用Tyrode’s液（臺(tái)式液，g／L）：NaCl 8.0，CaCl20.2，KCl 0.2，MgCl20.1，NaHCO31.0，KH2PO40.05，葡萄糖1.0。無鈣 Tyrode’s液以 EDTA代替 CaCl2外，其余成分相同。家兔 （2.5±0.4）kg，雌雄兼用（由濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供）。BL-420F生物信號(hào)處理系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），JH-2型肌張力傳感器（中國(guó)北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所產(chǎn)品）。

1.2 家兔離體小腸平滑肌標(biāo)本的制備

取健康家兔，禁食24 h后，用木槌猛擊兔頭枕部致死。迅速沿腹正中線切開腹部，取近回盲部小腸20 cm。置于盛有室溫Tyrode’s液的燒杯中，洗凈腸內(nèi)容物。將其剪成2～3 cm的腸段作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

1.3 收縮活動(dòng)的記錄方法

將標(biāo)本的一端固定于L形鉤上，置于盛有20 ml Tyrode’s液的平滑肌槽中；另一端連接張力換能器，持續(xù)通混合氣體（0.95O2＋0.05CO2，每秒 1～2個(gè)氣泡），溫度（37±0.5）℃ ，張力負(fù)荷2 g，平衡1 h，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，開始實(shí)驗(yàn)。

1.4 槲皮素對(duì)小腸平滑肌自主收縮活動(dòng)的影響

待回腸收縮曲線穩(wěn)定后，累計(jì)加入槲皮素，使終濃度分別達(dá) 20、40、60、80、100μmol／L，加藥間隔時(shí)間為5min，觀察槲皮素對(duì)家兔小腸平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)的影響。用區(qū)間測(cè)量法測(cè)量給藥前1 min及給藥后第5分鐘的張力，以給藥前的值為100%，按公式計(jì)算給藥后小腸舒張百分率［6］。

1.5 槲皮素對(duì)乙酰膽堿、氯化鋇及組胺所致腸痙攣性收縮的影響

待回腸收縮曲線穩(wěn)定后，首先給予乙酰膽堿（0.1μmol／L）、氯化鋇（10mg／L）或組胺（5mg／L），當(dāng)刺激平滑肌收縮達(dá)平臺(tái)后，再累計(jì)加入槲皮素（終濃度同上），觀察其對(duì)乙酰膽堿、氯化鋇或組胺刺激所致痙攣性收縮腸平滑肌是否具有舒張作用。

1.6 槲皮素對(duì)BayK8644作用的影響

觀察槲皮素100μmol／L預(yù)孵育10min后對(duì)Bay K8644（0.5μmol／L）致小腸平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)的影響。對(duì)照組采用相等容積的DMSO。

1.7 RR、HP或L-NAME預(yù)處理對(duì)槲皮素腸舒張腸平滑肌的影響

腸平滑肌標(biāo)本穩(wěn)定后，分別加入ryanodin受體阻斷劑 RR（10μmol／L）、三磷酸肌醇（trisphosphate inositol，IP3）受體阻斷劑 HP（50 mg／L）和 L-NAME（100 μmol／L）共孵育 15 min后，立即加入終濃度為 100 μmol／L的槲皮素。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較采用單因素方差分析中的LSD方法。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)家兔離體腸平滑肌收縮活動(dòng)的影響

20～100μmol／L槲皮素能夠劑量依賴性抑制小腸平滑肌自發(fā)收縮，使舒張作用增強(qiáng)。對(duì)組胺、乙酰膽堿以及氯化鋇所致腸平滑肌痙攣性收縮亦均有一定的抑制作用，但強(qiáng)度不同。槲皮素濃度為100 μmol／L時(shí)，對(duì)組胺痙攣性收縮的抑制百分率為83.68%；乙酰膽堿次之，抑制百分率為 78.68%；而對(duì)氯化鋇引起痙攣性收縮抑制百分率為74.42%；但對(duì)腸平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)抑制作用較弱，僅為58.92%（表 1，圖 1）。

Fig.1 Effect of quercetin on spontaneous contractive activity of rabbit small intestine smoothmuscle

Tab.1 Effectof quercetin on the contraction of small intestine smoothmuscle of rabbits in vitro（±s，n＝8）

Tab.1 Effectof quercetin on the contraction of small intestine smoothmuscle of rabbits in vitro（±s，n＝8）

Que：Quercetin*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group Rate of relaxition（%）Que 20μmol／L Que 40μmol／L Que 60μmol／L Que 80μmol／L Que 100μmol／L Control 31.52±6.65 37.11±7.52 39.59±5.76 58.93±7.81 58.92±6.20 Histamine（5mg／L） 66.65±10.36** 71.52±9.16** 76.45±8.51** 79.69±7.85** 83.68±5.54**Acetylcholine（0.1μmol／L）35.58±5.92 55.20±6.68* 68.08±8.60* 73.63±8.28* 78.68±8.55**Bacl2（10mg／L） 32.27±7.51 44.15±8.83 59.24±7.57* 68.61±4.87* 74.42±3.32**

2.2 槲皮素對(duì)Bay K8644作用的影響

Bay K8644是 L型 Ca2＋通道開放劑，Bay K8644（0.5μmol／L）使小腸平滑肌自發(fā)收縮張力由（1.03±0.03）g增加到（1.27±0.09）g（P＜0.01）；而槲皮素（60μmol／L）預(yù)處理后再加入 Bay K8644（0.5μmol／L）收縮張力降為（0.69±0.03）g（P＜0.01，圖 2）。

Fig.2 Influences of quercetin（60μmol／L）on the Bay K8644（0.5μmol／L）induced changes on spontaneous contractile activity of rabbit small intestine smoothmuscle（n＝6～8）

2.3 RR、HP或L-NAME預(yù)處理對(duì)槲皮素舒張腸平滑肌的影響

與槲皮素組比較，肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑RR（10μmol／L）預(yù)孵育后對(duì)槲皮素舒張腸平滑肌作用無明顯影響（P＞0.05）；而 IP3受體阻斷劑 HP（50 mg／L）預(yù)孵育后可減弱槲皮素的舒張腸平滑肌作用，對(duì)腸平滑肌的舒張百分率由39.44%±5.19%減為 25.45%±3.42%（P＜0.05）。L-NAME預(yù)孵育使槲皮素舒張腸平滑肌作用由原減弱為29.76%±4.14%（P＜0.05，圖 3）。

Fig.3 Influences of RR（10μmol／L）、HP（50 mg／L）and LNAME（100μmol／L）on the quercetin（60μmol／L）induced changes on spontaneous contractile activity of rabbit small intestine smoothmuscle（±s，n＝8）

3 討論

胃腸平滑肌痙攣可引起腹痛、腹瀉，是臨床常見的疾病之一。目前研究認(rèn)為胃腸道上主要存在M膽堿受體、組胺受體、5-HT受體及多種胃腸激素等受體。乙酰膽堿（Ach）是平滑肌內(nèi)興奮傳遞的化學(xué)物質(zhì)能，激動(dòng)M膽堿受體使胞內(nèi)第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DG）濃度上升，進(jìn)而引起Ca2＋釋放和底物蛋白磷酸化激發(fā)平滑肌產(chǎn)生收縮效應(yīng)。組胺（histamine，HA）是具有多種生理功能的胺類物質(zhì)。能被傳統(tǒng)抗組胺藥所阻滯的豚鼠平滑肌上的組胺受體被稱為H1型組胺受體（H1-R），HA作用于H1-R使鈣通道開放，胞內(nèi)游離Ca2＋濃度升高，促發(fā)胃腸道平滑肌收縮［7］。而BaCl2是通過釋放細(xì)胞內(nèi)的Ca2＋而引起腸管平滑肌痙攣［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素能劑量依賴性地抑制腸平滑肌的自發(fā)性收縮及乙酰膽堿、組胺或BaCl2引起痙攣性收縮，但對(duì)痙攣收縮腸平滑肌的作用明顯強(qiáng)于自發(fā)性收縮腸平滑?。≒＜0.05或P＜0.01）。

因乙酰膽堿、組胺以及BaCl2引起腸管平滑肌痙攣性收縮，都與腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋增多有關(guān)。故推斷槲皮素抑制腸平滑肌痙攣性收縮與降低細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度有關(guān)。腸道平滑肌收縮所需的大部分鈣是在動(dòng)作電位發(fā)生時(shí)從細(xì)胞外進(jìn)入肌細(xì)胞內(nèi)的，小部分來源于肌漿網(wǎng)，當(dāng)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高到一定水平（1～50μmol／L）時(shí)，與肌鈣蛋白或肌調(diào)蛋白結(jié)合，觸發(fā)平滑肌收縮［9］。為此我們進(jìn)一步研究了槲皮素對(duì)外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放的影響。

腸平滑肌中主要的鈣通道是L型電壓依賴性鈣通道（L-Ca2＋），實(shí)驗(yàn)中給予小腸平滑肌L型鈣通道的開放劑Bay K8644，大量的鈣離子通過L型鈣通道進(jìn)入平滑肌細(xì)胞內(nèi)，使其自發(fā)收縮力提高。而給予槲皮素后，這種效應(yīng)被明顯抑制（P＜0.01），由此可以推斷槲皮素可能阻斷L型鈣通道，抑制Bay K8644引起的外鈣內(nèi)流，從而抑制小腸平滑肌的收縮。

細(xì)胞內(nèi)Ca2＋的釋放主要來自肌漿網(wǎng)。平滑肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2＋釋放主要是通過IP3受體和ryanodine受體來完成。當(dāng)這些受體被激活開放時(shí)，引起肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2＋釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)Ca2＋濃度升高，腸平滑肌發(fā)生收縮。槲皮素的活性作用有可能通過抑制IP3途徑和（或）ryanodine受體途徑完成。為此，我們觀察了HP及RR預(yù)處理下槲皮素對(duì)腸平滑肌的作用，以探討這兩條途徑是否介導(dǎo)槲皮素的舒張平滑肌作用。預(yù)先應(yīng)用肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑RR后，對(duì)槲皮素舒張腸平滑肌作用無明顯影響（P＞0.05），而應(yīng)用 IP3受體阻斷劑HP則減弱槲皮素舒張作用，由此推斷，IP3受體途徑抑制引起內(nèi)鈣釋放減少可能介導(dǎo)槲皮素舒張腸平滑肌作用，但其對(duì)肌漿網(wǎng)ryanodine受體途徑引起內(nèi)鈣釋放無明顯影響。

有研究表明［10］，NO通過激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，使胞質(zhì)cGMP濃度升高，胞內(nèi)Ca2＋降低，導(dǎo)致平滑肌舒張。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用NO合酶抑制劑L-NAME預(yù)孵育的條件下，槲皮素舒張腸平滑肌作用減弱（P＜0.05），說明槲皮素對(duì)小腸平滑肌的抑制作用亦可能與NO濃度有關(guān)，關(guān)于其對(duì)NO下游鳥苷酸環(huán)化酶有無影響尚待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，槲皮素抑制家兔離體小腸平滑肌收縮活動(dòng)的機(jī)制可能為增加小腸平滑肌NO濃度，抑制外鈣內(nèi)流和IP3受體途徑引起內(nèi)鈣釋放，最終使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，平滑肌舒張而達(dá)到解除腸平滑肌痙攣。但槲皮素對(duì)肌漿網(wǎng)ryanodine受體途徑引起內(nèi)鈣釋放無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)研究為槲皮素用于腸痙攣性疾病治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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