rhAng-1對(duì)局灶性腦缺血／再灌注大鼠血腦屏障血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接的影響*

于 航，賈慶波，薛一雪

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，黑龍江大慶163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院胸外科，黑龍江大慶163319；3.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，遼寧沈陽110001）

急性腦梗死是目前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，腦缺血致腦細(xì)胞損傷。目前認(rèn)為，急性腦梗死的最佳治療是盡快溶栓。但溶栓治療有可能導(dǎo)致腦缺血／再灌注損傷，容易引起腦水腫，甚至腦出血，其主要原因是由于血腦屏障（blood brain barrier，BBB）通透性增加。

BBB由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、基底膜等成分組成，其中相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間的連接，如緊密連接和粘附連接是保持血腦屏障完整性的重要功能單位，是決定血腦屏障通透性的主要因素，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的分布和／或表達(dá)水平影響緊密連接的開放或關(guān)閉。腦缺血及其再灌注引起的一系列神經(jīng)炎癥反應(yīng)、興奮性谷氨酸中毒、細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等可進(jìn)一步增加血腦屏障通透性。

血管生成素 （angiopoietin，Ang）是一族特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，其中血管生成素1（Ang-1）主要發(fā)揮保持血管內(nèi)皮的穩(wěn)定性，促使血管成熟的作用。在目前已知的能夠促進(jìn)血管生長的因子中，Ang-1是既能夠促進(jìn)血管再生又能夠降低血管通透性的少數(shù)因子之一，已用于膿毒血癥、移植血管硬化、糖尿病視網(wǎng)膜病變、心肌缺血等疾病的臨床前期治療［1］。Ang-1在正常腦組織中表達(dá)很少，腦缺血等病理狀態(tài)下Ang-1的血漿含量發(fā)生改變，血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管旁細(xì)胞Ang-1的特異表達(dá)與腦缺血半暗帶血管重建、側(cè)支循環(huán)的形成和BBB的完整性密切相關(guān)［2］。

本研究利用局灶性腦缺血／再灌注大鼠模型，頸總動(dòng)脈注射重組人血管生成素1（以下簡稱rhAng-1），研究局灶性腦缺血／再灌注7 d內(nèi)，rhAng-1對(duì)血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞間連接的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 Wister健康大鼠 （n＝80），雄性、250～300 g。中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于室溫和光照可控的飼養(yǎng)室內(nèi)（22℃；每12 h為光照、黑暗一循環(huán)；光照從07∶00開始），自由進(jìn)食水。

1.1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)儀器 重組人血管生成素1（R＆D公司）；紅四氮哇 （2，3，5-triphenyltetrazolium，TTC，Sigma公司）；伊文氏藍(lán) （Fluka公司進(jìn)口分裝）；大鼠腦立體定位儀（日本光電株式會(huì)社）；激光多普勒腦血流儀 （英國 Moor instruments公司）；酶標(biāo)儀（美國 Molecular Devices公司）；-70℃超低溫冰箱（SANYO公司）；恒溫震蕩水浴 （HZS-H，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；旋渦混合器 （XW-80C型，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；Chemi Imager 5500 V2.03掃描系統(tǒng)；Fluor Chen 2.0和 Motic Images Advanced 3.2分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 制備局灶性腦缺血／再灌注動(dòng)物模型 參照Longa大腦中動(dòng)脈線栓法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）制備局灶性腦缺血／再灌注動(dòng)物模型。大鼠腹腔注射 10%水合氯醛（0.3 ml／kg），麻醉后，仰臥固定，常規(guī)消毒后行頸部正中切口，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸外動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，將直徑為0.26 mm涂有肝素的尼龍線經(jīng)頸總動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈約18～20mm，感覺有阻力時(shí)則為阻斷大腦中動(dòng)脈入口，栓塞成功后固定尼龍線，2 h后拔出尼龍線進(jìn)行再灌注。

1.2.2 激光多普勒血流儀檢測腦血流 麻醉大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀，正中矢狀切開皮膚，在冠狀縫后1 mm與矢狀縫右5 mm交點(diǎn)處鉆一小孔至硬腦膜，直徑2 mm，該區(qū)域?yàn)槿毖诵膮^(qū)域。將激光多普勒血流儀探頭插入孔內(nèi)，測量大鼠大腦中動(dòng)脈血流變化。分別記錄正常狀態(tài)下腦血流基礎(chǔ)值、缺血2 h內(nèi)以及再灌注不同時(shí)間點(diǎn)血流變化。要求MCAO后腦流量迅速降到基礎(chǔ)值的30%以下，不符合此標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物剔除。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠隨機(jī)分為8組 （n＝10），假手術(shù)組、缺血對(duì)照組、生理鹽水＋缺血／再灌注12 h，48 h，7 d組和 rhAng-1＋缺血／再灌注 12 h，48 h，7 d組。假手術(shù)組手術(shù)操作與模型制備相同，但不插尼龍線；缺血對(duì)照組僅缺血不再灌；rhAng-1各組大鼠頸總動(dòng)脈注射 rhAng-1（1μg／kg），與再灌注同時(shí)開始，每24 h注射一次直至處死；生理鹽水各組頸總動(dòng)脈注射同劑量生理鹽水。

1.2.4 腦梗死體積測定 大鼠過量麻醉致死后迅速斷頭取腦，置于-20℃冰箱快速冷凍30 min，從額極開始由前向后每隔2mm冠狀切取腦組織5片，置于2%TTC溶液中，37℃水浴避光孵育30 min，數(shù)碼相機(jī)拍照。用圖像分析軟件（Motic Images Advanced 3.2）處理計(jì)算腦梗死體積。

60只雄性BALB/C小鼠購自中科院生物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠體重為30±2 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有小鼠隨機(jī)分為3組，采分別為治療組、損傷組和對(duì)照組，每組均為20只小鼠，

1.2.5 血腦屏障通透性的檢測 向麻醉大鼠股靜脈按 2ml／kg bw注入 2%伊文氏藍(lán)（Evans blue，EB），2 h后經(jīng)左心室灌注生理鹽水直至流出清亮液體，斷頭取腦，按1 ml／100 mg腦組織加入甲酰胺溶液，60℃水浴抽提24 h，用酶標(biāo)儀在620 nm波長測光密度值。作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到腦組織EB含量（μg／g腦重量）。

1.2.6 神經(jīng)功能評(píng)分 參照Zea Longer進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分：0分，無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常者；1分，不能完全伸展左側(cè)前爪者；2分，爬行時(shí)出現(xiàn)向左側(cè)追尾轉(zhuǎn)圈者；3分，行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒者；4分，不能自發(fā)行走并伴意識(shí)障礙者。2～4分者納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7 RT-PCR法檢測緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、Zonula occluding-1（ZO-1）和粘附連接蛋白 VE-cadherinmRNA表達(dá)變化 取缺血區(qū)腦微血管段約100 mg按Trizol試劑說明書方法提取組織總RNA。取1μg進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR引物序列及反應(yīng)條件見表1。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂凝膠電泳分析。電泳后在紫外燈下拍攝照片，然后用Chemi Imager 5500凝膠成像處理系統(tǒng)對(duì)每一標(biāo)本的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行灰度掃描，以β-actin密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)值以兩者之積分吸光度的比值表示， 以對(duì)照組的比值作為標(biāo)準(zhǔn)1.0。

Tab.1 Oligonucleotides used for RT-PCR and their amplicon size，genbank accession number and annealing temperatures

1.2.8 Western blot法檢測緊密連接相關(guān)蛋白 occludin、ZO-1和粘附連接蛋白VE-cadherin以及信號(hào)分子PKCα和p-MLC表達(dá)水平變化 取缺血區(qū)腦微血管段，勻漿離心、測定蛋白濃度；蛋白分離分別采用7.5%、10%、15%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上；ZO-1（1∶500稀釋）、occludin（1∶500稀釋）、VE-cadherin（1∶500稀釋）、PKCα（1∶500稀釋）、p-MLC（1∶500稀釋）、t-MLC（1∶500稀釋）、β-actin抗體（1∶4 000稀釋），4℃孵育過夜；相應(yīng)二抗室溫孵育2 h；ECL發(fā)光，采用Chemi Imager5500V 2.03軟件掃描膠片，F(xiàn)luor Chem 2.0圖像分析儀對(duì)條帶積分光密度進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間采用單因素方差分析之Bonferroni檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠大腦中動(dòng)脈供血區(qū)血流變化

激光多普勒血流儀檢測生理鹽水各組與rhAng-1各組大鼠大腦中動(dòng)脈血流變化，大鼠腦血流以基礎(chǔ)值百分比表示（圖1）。結(jié)果顯示給予生理鹽水各組和給予rhAng-1各組大鼠再灌注各時(shí)間點(diǎn)缺血區(qū)腦血流量較MCAO時(shí)顯著增高（P＜0.01），但給予rhAng-1與給予生理鹽水大鼠同時(shí)間點(diǎn)缺血區(qū)腦血流變化無顯著差異（圖2）。

2.2 rhAng-1顯著降低局灶性腦缺血／再灌注大鼠腦梗死體積

Fig.1 Effect of rhAng-1（1μg／kg）on the cerebral blood flow（CBF）in focal cerebral ischemia／reperfusion rats

Fig.2 Effect of rhAng-1（1μg／kg）on the cerebral blood flow（CBF）in focal cerebral ischemia and reperfusion rats（±s，n＝10）

Fig.3 rhAng-1（1μg／kg）decreased brain infarctvolume in focal cerebral ischemia／reperfusion rats（±s，n＝10）

2.3 rhAng-1顯著降低局灶性腦缺血／再灌注大鼠血腦屏障通透性

應(yīng)用伊文氏藍(lán)滲透性實(shí)驗(yàn)評(píng)估BBB通透性變化。假手術(shù)組大鼠腦組織未見藍(lán)染，給予生理鹽水大鼠缺血區(qū)腦組織藍(lán)染，腦切片可見缺血區(qū)額頂部皮質(zhì)、尾殼核外側(cè)部及中部藍(lán)染。給予生理鹽水大鼠各時(shí)間點(diǎn)缺血區(qū)腦組織EB含量與假手術(shù)組相比顯著升高（P＜0.01）；給予 rhAng-1大鼠缺血區(qū)腦組織藍(lán)染程度與同時(shí)間點(diǎn)給予生理鹽水大鼠相比顯著下降（P＜0.01，圖 4）。

2.4 rhAng-1對(duì)局灶性腦缺血／再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響

應(yīng)用Zea Longa法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能損傷的評(píng)分。與假手術(shù)組相比，給予生理鹽水各組及rhAng-1各組大鼠的分?jǐn)?shù)顯著升高（P＜0.01）；給予rhAng-1大鼠評(píng)分?jǐn)?shù)與同時(shí)間點(diǎn)給予生理鹽水大鼠相比無明顯差異（圖5）。

2.5 rhAng-1顯著增加局灶性腦缺血／再灌注時(shí)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的occludin、ZO-1和VE-cadherin表達(dá)

2.5.1 RT-PCR法檢測腦缺血／再灌注 12 h、48 h、7 d時(shí)，occludin、ZO-1和 VE-cadherin mRNA表達(dá)，以及應(yīng)用 rhAng-1后 occludin、ZO-1和 VE-cadherin mRNA表達(dá)的變化 與假手術(shù)組大鼠相比，其他各組大鼠缺血側(cè)腦組織occludin、ZO-1和VE-cadherin的mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）；與同時(shí)間點(diǎn)給予生理鹽水大鼠相比，給予rhAng-1大鼠缺血側(cè)腦組織occludin、ZO-1和 VE-cadherin mRNA表達(dá)均顯著增加（P＜0.01，圖 6）。

Fig.4 Content of EB showed that rhAng-1（1μg／kg）decreased the BBB permeability in focal cerebral ischemia／reperfusion rats（±s，n＝8）

Fig.5 Effect of rhAng-1（1μg／kg）on the neurobehavioral dysfunction score in focal cerebral ischemia／reperfusion rats（±s，n＝8）

2.5.2 Western blot法檢測局灶性腦缺血／再灌注12 h、48 h、7 d時(shí)，occludin、ZO-1和 VE-cadherin蛋白表達(dá)以及應(yīng)用rhAng-1后這些蛋白表達(dá)的變化 與假手術(shù)組大鼠相比，其他各組大鼠缺血側(cè)腦組織三種蛋白表達(dá)皆顯著降低（P＜0.01）；與同時(shí)間點(diǎn)給予生理鹽水大鼠相比，給予rhAng-1大鼠缺血區(qū)腦組織三種蛋白表達(dá)均顯著增加：occludin（P＜0.01或P＜0.05）、ZO-1（P＜0.01）和 VE-cadherin（P＜0.01，圖 7）。

Fig.6 RT-PCR analysis revealed that rhAng-1（1μg／kg）induced increasing mRNA levels of ZO-1，occludin，and VE-cadherin in focal cerebral ischemia／reperfusion rats（±s，n＝8，10）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠在局灶性腦缺血／再灌注12 h，48 h和7 d，BBB通透性顯著高于假手術(shù)組，應(yīng)用rhAng-1能夠顯著降低再灌注大鼠BBB的通透性，顯著減少再灌注12 h，48 h和7 d組大鼠腦梗死體積，但未明顯提高神經(jīng)功能損傷評(píng)分。結(jié)果證明，rhAng-1對(duì)局灶性腦缺血／再灌注大鼠BBB的通透性具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用與rhAng-1增加BBB內(nèi)皮細(xì)胞間連接蛋白的表達(dá)有關(guān)。

Fig.7 Western blot assay showed that rhAng-1（1μg／kg）induced increasing protein levels of ZO-1，occludin，and VE-cadherin in focal cerebral ischemia and reperfusion rats（±s，n＝8）

局灶性腦缺血／再灌注大鼠腦血流變化顯示，再灌注后缺血區(qū)腦血流增加，與MCAO時(shí)存在顯著差異，但缺血區(qū)腦血流在再灌注7 d內(nèi)并沒有恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，說明此期間的再灌注是持續(xù)的低灌注水平。BBB通透性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示給予生理鹽水大鼠再灌注12 h，48 h和7 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB通透性顯著高于假手術(shù)組，與Strbian用磁共振法檢測到的腦缺血／再灌注BBB通透性變化相一致［3］。提示再灌注期間腦血流供給的不足與BBB的通透性增加可能存在一定關(guān)系。

再灌注開始引起腦血流急劇升高，中性粒細(xì)胞大量粘附于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞阻塞微血管，引發(fā)“無復(fù)流”現(xiàn)象，形成持續(xù)低灌注，缺血區(qū)域局部血液供給減少，腦組織代謝障礙，血管內(nèi)皮細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生腫脹，造成BBB通透性增加［4］。能量代謝障礙伴隨著的氧化應(yīng)激反應(yīng)、離子失衡、神經(jīng)遞質(zhì)釋放與重?cái)z取障礙，導(dǎo)致BBB損傷加?。?］。隨著再灌注時(shí)間的延長，中性粒細(xì)胞大量滲出，小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，各種炎癥因子釋放直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使BBB通透性持續(xù)增加，繼發(fā)腦水腫、甚至腦出血［6］。Kuroiwa等研究表明，腦缺血／再灌注損傷引起B(yǎng)BB通透性呈雙峰變化，第一高峰為再灌注早期，此期又為充血期，由于急劇升高的腦血流破壞腦血管內(nèi)皮細(xì)胞引起B(yǎng)BB通透性增高，而持續(xù)低灌流繼發(fā)的炎癥反應(yīng)引起B(yǎng)BB通透性變化出現(xiàn)第二高峰［7］。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在局灶性腦缺血／再灌注損傷時(shí)BBB通透性增高的第一個(gè)高峰發(fā)生在再灌后12 h，第二個(gè)高峰在再灌后48 h。基于此，本研究選擇再灌注12 h，48 h和7 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察BBB通透性變化。

血管生成素是一種有效的血管生成因子，是RNase超家族中惟一具有促血管生成能力的成員，也是目前已知的所有血管生成因子中獨(dú)具核糖核酸酶活性的因子。Ang-l的功能有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞出芽、遷徙和成熟以及抗炎、維持血管穩(wěn)定和抗血管滲漏［8］。Ang-l發(fā)揮抗皮膚血管滲漏的作用是通過穩(wěn)定細(xì)胞間粘附連接復(fù)合體實(shí)現(xiàn)的［9-10］。Ang-1在正常腦組織中表達(dá)很少，腦缺血等病理狀態(tài)下Ang-1的血漿含量發(fā)生改變，血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管旁細(xì)胞Ang-1的特異表達(dá)與腦缺血半暗帶血管重建、側(cè)支循環(huán)的形成和BBB的完整性密切相關(guān)［2］。關(guān)于腦缺血與Ang-1表達(dá)水平關(guān)系的研究表明Ang-1在正常生理?xiàng)l件下能夠參與維持正常成年大腦的BBB完整性；腦缺血發(fā)生后，Ang-l表達(dá)減少、作用減弱加重BBB完整性的破壞。本研究通過在腦缺血／再灌時(shí)給予外源性 rhAng-l觀察rhAng-l對(duì)病理狀態(tài)下的BBB是否具有保護(hù)作用。rhAng-l的給藥途徑及劑量通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出（頸總動(dòng)脈給藥，1μg／kg）。結(jié)果證明 rhAng-l對(duì)局灶性腦缺血／再灌注大鼠BBB通透性具有保護(hù)作用。rhAng-l保護(hù)BBB的確切分子機(jī)制有待進(jìn)一步證明。

［1］ MacGregor D G，Avshalumov M V，Rice M E.Brain edema induced byin vitroischemia：causal factors and neuroprotection［J］.JNeurochem，2003，85（6）：1402-1411.

［2］ Warach S，Latour L L.Evidence of reperfusion injury，exacerbated by thrombolytic therapy，in human focal brain ischemia using a novel imagingmarkerofearly blood-brain barrier disruption［J］.Stroke，2004，35（11 Suppl 1）：2659-2661.

［3］ Glantz L，Avramovich A，Trembovler V，et al.Ischemic preconditioning increasesantioxidants in the brain and peripheralorgans after cerebral ischemia［J］.Exp Neurol.2005，192（1）：117-124.

［4］ Shyamaladevi N，Jayakumar A R，Sujatha R，et al.Evidence that nitric oxide production increases gamma-amino butyric acid permeability of blood-brain barrier［J］.Brain Res Bull，2002，57（2）：231-236.

［5］ Allan SM，Parker LC，Collins B，etal.Cortical cell death induced by IL-1 ismediatedviaactions in the hypothalamus of the rat［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2000，97（10）：5580-5585.

［6］ Hayashi T，Hasegawa K，Morimoto M，et al.Effectof antibodies to intercellular adhesionmolecule（ICAM）-1 and lymphocyte function-associated antigen（LFA）-1 on cytokinemRNA expression in reovirus type-2-triggered autoimmune insulitis in suckling DBA／1mice［J］.JComp Pathol，2003，128（4）：283-288.

［7］ Gao D，Zhang X，Jiang X，etal.Resveratrol reduces the elevated level of MMP-9 induced by cerebral ischemia-reperfusion inmice［J］.Life Sci，2006，78（22）：2564-2570.

［8］ Papadopoulos M C，Krishna S，Verkman A S.Aquaporinwater channelsand brain edema［J］.Mt Sinai JMed，2002，69（4）：242-248.

［9］ Weiner H L，Weiner LH，Swain JL.Tissue distribution and developmental expression of themessenger RNA encoding angiogenin［J］.Sci，1987，237（4812）：280-282.

［10］ Fett JW，Strydom D J，Lobb R R，et al.Isolation and characterization ofangiogenin，an angiogenic protein from human carcinoma cells［J］.Biochemistry，1985，24（20）：5480-5486.